木糖还原酶基因在大肠杆菌中活性表达.pdfVIP

维普资讯 第 29卷 第 3期 华 侨 大 学 学 报 (自然 科 学 版 ) VoII29 No．3 2008年 7月 JournalofHuaqiaoUniversity(NaturalScience) Ju1．2008 文章编号： 1000—5013(2008)03—0383—04 木糖还原酶基因在大肠杆菌中活性表达 王晓霞，方柏山，李雯君 (华侨大学 工业生物技术福建省高等学校重点实验室，福建 泉州，362021) 摘要： 利用聚合酶链式反应 (PCR)方法，从休哈塔假丝酵母 (Candidashehatae)基因组 DNA扩增得到了木 糖还原酶(XyloseReductase，XR)基因，并在大肠杆菌中活性表达．重组菌在诱导 6h时的XR表达量最大， 约为总蛋白的2O ．实验考察不同质量浓度的乳糖和异丙基一D一硫代半乳糖苷 (IPTG)对酶活性的影响，结 果表明，重组菌在以乳糖作为诱导剂时酶活最高为232．38t~kat·g一，以 IPTG作为诱导剂时酶活最高为 206．04／~kat·g ． 关键词： 木糖还原酶；乳糖诱导；聚合酶链式反应；大肠杆菌；活性表达 中图分类号： TQ923；Q789 文献标识码： A 木糖醇 (戊五醇)是一种五碳糖醇，广泛存在于各种水果和蔬菜中，它是人类在葡萄糖醛酸一木酮糖 循环代谢的中间体，在其他动物代谢中也有发现．木糖醇在食用后不消耗胰岛素l】]，可作为糖尿病人的 营养剂，另它具有特殊的防龋功能，可作为儿童防龋食品的添加剂．木糖醇还具备类似甘油和其他多元 醇的许多优异特性，因而广泛用于国防、医药、化工、皮革、涂料、化妆品及食品行业等l2。]．目前，国内外 工业规模生产木糖醇采用化学法催化加氢得到，工艺复杂、成本高、产量低．近来由于人们期望降低下游 加工成本，使微生物转化生产木糖醇受到广泛的重视．微生物转化法是利用微生物中的还原酶来生产木 糖醇，某些天然利用木糖的酵母菌在代谢过程中能够产生木糖醇，但 由于木糖是碳源及能源物质，有相 当部分的木糖要转变为生物量，影响木糖醇得率的提高l-1]．基因工程菌打破了原有的代谢途径_l3]，可以 使木糖转化为木糖醇，又不会作为碳源及能源，因而不会产生相关代谢副产物．本文将休哈塔假丝酵母 (C shehataeCICC1766)中编码木糖还原酶(xR)的基因xr在大肠杆菌中稳定高效表达，考察了诱导 时间对表达量的影响，及不同物质量浓度乳糖和异丙基一D一硫代半乳糖苷 (IPTG)作为诱导剂时对酶 活的影响，并对重组 E．coli发酵木糖产木糖醇做了初步研究． 1 材料与方法 1．1 材料 休哈塔假丝酵母C shehataeCICCl766(中国工业微生物菌种保藏中心)，E coliDH5a(福建厦 门大学生命科学学院彭宣宪教授惠赠)，质粒 pET一22b(福建厦门亚热带生态研究所)；E．coliBL21 (DE3)plysS(简写为E．coli，广东深圳晶美生物工程有限公司)；TaqTMDNA聚合酶以及限制性内切 酶NdeI和BamHI(TAKARA公司)；T DNA连接酶(PR0MEGA公司)；琼脂糖凝胶回收试剂盒和 质粒回收试剂盒 (OMEGAB10一TEK公司)；GeneRulerTMLadderMix(广东深圳晶美生物工程有限公 司)；还原型辅酶 I(NADH，AMRESCO公司)．其他试剂均为分析纯，引物合成与测序 由北京奥科生物 技术有限公司完成． 1．2 实验方法 收稿 日期 ： 2007——10—+08 作者简介： 王晓霞 (1981一)，女；通信作者：方柏山(1957一)，男 ，教授，博士生导师，主要从事微生物生化的研究．E mail：fangbs@hqu．edu．CIL 基金项 目： 福建省 自然科学重点基金资助项 目(C96068) 维普资讯 维普资讯 第3期 王晓霞，等：木糖还原酶基因在大肠杆菌中活性表达