荧光光度法测定维生素B2.docVIP

实验、荧光光度法测定维生素B2 一、实验目的 1．掌握荧光光度分析的基本原理。2．掌握荧光光度计的基本结构及操作技术。 3．了解荧光光度计的应用。 二、实验原理 某些物质经紫外光照射能发出比原激发光的频率低，波长长的可见光，这种光称为荧光。各种物质经紫外光激发后能发出的荧光特性与物质的化学性质有关。在激发光强度和所通过的溶液厚度不变时，在一定浓度范围内该物质所产生的荧光强度可用下式表示： IF＝2.3 KкbcI0 当I0一定时, IF＝Kc 式中K’取决于荧光效率，是荧光分子的摩尔吸光系数，b是液槽厚度，c是荧光物质的浓度。由此可见光在一定条件下，荧光强度与物质的浓度呈线性关系。用已知浓度的标准与待测样品同样操作，通过测定荧光强度（F），按前述的标准曲线法和标准对照法，求得待测物质的浓度。 维生素B2，又叫核黄素，是橘黄色无臭的针状结晶。维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂。在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。 维生素B2水溶液在470nm或紫外光照射下会发生绿色荧光，荧光峰在520nm，在pH 5～7的溶液中荧光强度最大，在pH 11的碱性溶液中荧光消失。多维葡萄糖中含有维生素B1，B2，C，D2及葡萄糖均不干扰维生素B2的测定。由于维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生光分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧光强的多。因此，测量维生素B2的荧光时，溶液要控制在酸性范围内，且须在避光条件下进行。 三、仪器和试剂 1． 荧光分光光度计 2． 40μg/mL维生素B2标准溶液：准确称取10.0mg维生素B2，用热蒸馏水溶解后，转入250mL棕色容量瓶中，冷却后加蒸馏水至标线，摇匀，置于暗处保存。 四、实验步骤 1. 激发光谱的测定及最佳激发波长的选择 固定检测（发射）波长520nm，用400 – 500 nm的光激发，找出最佳激发波长 2. 荧光光谱曲线的测定 于50mL容量瓶中，加入40μg/mL维生素B2标准溶液2.00 mL，加水至标线，摇匀。在荧光分光光度计上，用1cm荧光比色皿，激发波长470nm，发射波长为480 - 580nm范围内，测量溶液的荧光强度,并绘制荧光光谱曲线。 3． 标准曲线的绘制 于6只50mL容量瓶中，分别加入40μg/mL维生素B2标准溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、5.00mL，加水至标线，摇匀。在荧光分光光度计上，用1cm荧光比色皿于激发波长440nm，发射波长520nm处，测量标准系列溶液的荧光强度,并绘制标准(工作)曲线。 4． 未知维生素B2溶液的分析 五、数据处理 以相对荧光强度为纵坐标，荧光发射波长为横坐标绘制荧光光谱曲线。 以相对荧光强度为纵坐标，维生素B2的质量为横坐标绘制各标准曲线。 未知溶液的分析。 实验数据处理 （一）维生素B2的激发光谱图（固定发射波长为520nm，用400-500nm的光激发） 由图知，维生素B2的最佳激发波长约为450nm，以改波长作为之后荧光光谱的激发波长； （二）荧光光谱曲线的绘制 荧光光谱测定的实验条件如下： Instrument: RF-5301 Spectrum Type: EM Scan Range: 480.0nm to 580.0nm EX Wavelength: 450.0nm Sample Pitch: 1.0 Slit Width: EX:3.0nm EM:5.0nm Scan Speed: Super Sensitivity: High Response Time: Auto Shutter: Manual, Open 以下荧光光谱曲线为浓度为1.6μg/mL的维生素B2溶液的曲线 （三）标准曲线的绘制 选定波长为520nm，有1-5号溶液的浓度与荧光强度如下表 1 2 3 4 5 浓度/ug/mL 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 荧光强度 221.433 429.134 602.881 834.872 1016.057 绘制出标准曲线如下： 由曲线可求得，在试验条件下，维生素B2的荧光强度与浓度的关系的方程式为， I=498.75c+22.38 （四）未知维生素B2溶液的分析 实验测得未知维生素B2溶液在上述实验条件下的，在520nm处的荧光强度为446.839； 代入第（三）步求得的方程式I=498.75c+22.38，可求得未知维生素B2溶液的浓度为0.85ug/mL。