一种高效构建同源重组DNA片段的方法_融合PCR.pdfVIP

中国生物工程杂志 　Ch ina B iotechno logy, 2007 , 27 ( 8) : 53 ～58 技术与方法 一种高效构建同源重组 D NA 片段的方法 ———融合 PCR 李 　敏 　杨 　谦 (哈尔滨工业大学生命科学与工程系　哈尔滨 　15000 1) ( ) 摘要 　融合 PCR 技术 fu sion PCR 采用具有互补末端的引物 ,形成具有重叠链的 PCR 产物 ,通过 PCR 产物重叠链的延伸 ,从而将不同来源的任意 DNA 片段连接起来 ,此技术在不需要内切酶消 化和连接酶处理的条件下实现 DNA 片段的体外连接 ,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的 途径 。对原有的融合 PCR 技术进行改进 , 以 3 个同源重组线性 DNA 片段的构建为例 ,详细论述 了改进的融合 PCR 技术的反应过程及技术体系 。结果表明 ,改进的融合 PCR 技术可以同时进行 3个片段及 4 个片段的融合反应 ,产物长度均在 4. 5kb 以上 ,各同源重组片段在扩增过程中均无 突变发生 ,获得的片段可以用于后续实验分析 。 关键词 　融合 PCR 　重组片段 　同源臂 　抗性基因 中图分类号 　Q784 　　随着大规模的基因组测序计划的完成及大量表达 不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下 ,采用具有 ( ) 互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来 , 为 序列标签数据库 dbEST 的建立 ,基因组研究已由结构 基因组逐渐转向了功能基因组研究 [ 1 ] 。以同源重组技 同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径 。现有的 ( ) 术为基础 ,通过构建突变或缺失的同源媒介基因载体 融合 PCR 技术一般包括两步 PCR 反应 : 1 应用特异 并取代基因组中野生型的等位基因 ,进而研究 目的基 性引物 ,对各片段进行独立扩增 ,特异性引物的 5 末′端 因与表型性状间的关系 , 是研究动物 、植物 、微生物基 带有一段相邻片段的互补序列 ; ( 2 ) 在同一反应体系中 因功能的一种非常有用的遗传操作方法 [ 2～4 ] 。 加入各片段的混合物 , 以一对外侧引物进行融合片段 　　同源重组的发生依赖于载体与 目的片段间存在一 的全长扩增 。由于融合 PCR 技术正处于初步发展阶 定的 DNA 序列同源片段 , 同源片段越长越有利于同源 段 ,在应用过程中还存在很多方面的问题 ,如融合产物 重组事件的发生 。传统的同源重组载体的构建以限制 长度一般在 4. 0kb 以下、待融合片段的个数一般不超 性内切酶和 DNA 连接酶为基础 ,通过一系列的酶切连 过 3 个 、产物特异性差等 。Robert 等 [ 5 ] 应用融合 PCR 接反应将各片段逐步连接起来 。这种方法费时费力 , 方法进行了 3 个片段的融合反应 ,获得了 3 个融合产 不但在连接过程中引入 了不必要的酶切位点碱基序 物 ,融合产物长度最大为 4. 2kb。M aj id 等 [ 6 ] 在进行 4 列 ,而且对于长片段的连接有时难 以找到合适的酶切 个片段的连接时 ,首先将 425bp 的 alcA 启动子片段和 位点 。为了克服传统的同源重组载体构建方法 的缺 1. 9kb 的 p yr4 基因片段连接到 pUC19 载体上 ,得到一 陷 , 出现 了以聚合酶链式反应为基础 的片段拼接技 个 2. 1kb 的 p yr4 alcA 表达盒 , 再通过两步 PCR 将 ( )