不同型G基因缺失体在大肠杆菌中的克隆与表达s.pdfVIP

中国实验血液学杂志 Journal ＆ imentalHematology200(1：8(4】 -251 不同型Gs基因缺失体在大肠杆菌中的克隆与表达 楼金星 重墨焦_I 司艺玲 李杰之 赵亚力 叶棋浓。 黄翠芬。 一— — (北京军区总医院血液科 北京 100700) ； 摘要 在人类的一些肿瘤中已发现存在Gsa基因突变。本研究室在 白血病细胞系的研究中发现了 Gsa基因的3个缺失突变体以及野生型的Gsa(分别命名为G L-1．500bp；GsaI，2，300bp；G L-3， 200bp和G∞一4，1200bp)，并已在一些急性白血病患者中检测到。为进一步研究这些缺失体的结构、 功能和生物学意义，作者将克隆了GmL-1，GsaL-2和Gsa-4基因的质粒分别转化到大肠杆菌DH5n 中，提取DNA，采用特异引物进行PCR扩增，获得相应的目的基因，分别将其克隆到pET22b(+)表达 载体上．再转化大肠杆菌进行表达。经培养，取茵体行SDS电泳分析。研究结果：3个基因都有 相应分子量的蛋白表达，且均以包涵体彤式存在。这表明构建的这3个基因确具完整的基因鲒构，及 相应的蛋白表达。本研究为进一步研究它们的功能及其与白血病发生的关系打下了基础。 关键词 Gs基因 基因缺失体 基堕 基因表达 大肠杆菌 f， ．II===： Gsa是研究最多、与临床关系最密切的一种G蛋 L一1，pUC—GsaL-2，pUC—Gsa一4)为本室构建，可用 白，其主要功能是将受体接受的信号转导给腺苷酸环 SacI／KpnI或 NcoI／NotI切开；原核表达载体 化酶(AC)，使AC激活，同时也可直接作用于离子通 pET22b(+)为 Navagen公司产品；E，coliDH5a， 道而发挥作用。Gsa基因发生突变或转录产物发生 BL21(DE)和XL—Blue菌株均为本室保存。 异常剪接会导致疾病发生…。在肿瘤中已经发现存 酶及其它试剂 限制性内切酶及工具酶均购 自 在Gsa基因突变 。在本研究中分别以来 自Jurkat 华美生物工程公司，蛋白质分子量标准购于原平生 细胞株的人 白血病文库 cDNA和人 白血病细胞株 物公司，DNARapidPurificationKit为博太科技公 HI，60的mRNA反转录后的cDNA第一链为模板． 司产品，其它化学试剂均为国产分析纯试剂。 PCR扩增出Gsa基因完整编码区(命名为GsaL-1， 方法 500b口)，又在随后的白血病细胞中扩增出除500bp DNA操作 DNA 的酶切、回收、连接，质粒的 以外的其他条带，长度分别 为 300。200和 1200 转化与抽提，琼脂糖凝胶 电泳等均按参考文献 [8]提 bp。。。序列分析表 明，1200bp即是野生型的Gsa 供的方法进行。 (命名为Gsa一4)，而另外3种Gsa均为不改变阅读框 目的基因的PCR扩增 按参考文献公布的 架的不同缺失体，其中5OObp的缺失了野生型Gsa的 GsaDNA序列设计扩增引物，并在 5引物和 3引物 第23—249个氨基酸和第 254—260个氨基酸问的两 中分别引人NcoI和Xh。I位点，即： 个区域；300bp的缺失了第 34—337个氨基酸问的区 5引物序列 域；200b口的缺失了第6—329个氨基酸间的区域。 3引物序列 ACCI℃GAGCA0朗 G-rA 、GAcG： 这3个缺失体片段分别编码 160，90和 7{)个氨基酸。 以质粒 (pUC—GsaL一1，pUC—GsaL一2。pUC— 本实验采用DNA重组技术，将这3种Gsa缺失体基 Gsa-4)为模板进行PCR扩增，条件是95℃ 4分种， 因在大肠杆菌中进行了克隆、表达．以了瓣这 3种异 94℃30秒钟，52℃ 3o秒钟，72℃ 30秒钟，共进行