N_氨甲酰基水解酶基因工程菌的发酵工艺优化.pdfVIP

第33卷第1期 Vol.33No.1 2010年1月 Jan. 2010 N-氨甲酰基水解酶基因工程菌的发酵工艺优化 1 2 1 张小飞 , 王璐璐 , 张现林 (1.河北工业职业技术学院,河北 石家庄 050091；2.山东师范大学外国语学院,山东 济南 250014) [ 摘 要] 通过对基因工程菌发酵条件的研究，得知氯仿在0.02%的用量下可以通透细胞膜，使水解酶完全释放出来。最佳的 发酵优化条件：接种龄为16～20h，接种量为2%，初始pH值为7.0，培养温度为30℃ 3%,NaCl为0.2%,KHPO为0.05%,MgSO为0.05%,MnCl为0.02%,CoCl为0.01%。 2 4 4 2 2 到2.1u/mL，提高了87.5%。 [ 关键词] N-氨甲酰基水解酶；D-对羟基苯甘氨酸；发酵；优化 [ 中图分类号] TQ920.6 [ 文献标识码] A [ 文章编号] 1003-5095(201 N-氨甲酰基水解酶（D-Carbamoylase,Espf简称 7基因工程菌（由中南林业科技大学提 DCase）能高度专一性地脱氨甲酰化，形成游离氨基供）。 [1] 酸 。在微生物转化过程中，N-氨甲酰基水解酶和 1. 4 培养基 海因酶构成双酶来制备 D-对羟基苯甘氨酸 1. 4. 1 斜面培养基 (D-p-hydroxyphenylglycinD-pHPG)。首先， e，简称 在海因酶的作用下使苯海因(DL-HPH)转化为N-氨甲 2.0%；调pH为7.3。 酰基-D-对羟基苯甘氨酸(NC-D-pHPG)，之后在N-氨 1. 4. 2 种子培养基 [2] 甲酰基水解酶的作用下生成D-对羟基苯甘氨酸。 D- 对羟基苯甘氨酸是合成阿莫西林 7.1。 （amoxicilli、头孢羟氨苄（cefadroxin） l）的重要侧1. 4. 3 发酵培养基 [3] 链酸，国内外医药市场用量较大 。 目前，在D-pHPG 玉米浆 3%；KHPO 2 4 4 的多种制备方法中,生物酶转化法具有工艺简单、耗 0.05%；MnCl0.02%；CoCl0.01%；甘油 0.90%；葡萄 2 2 能少、产率高、成本低、光学纯度好、三废污染少等优 糖0.01%；调pH为7.0。 [4] 势 。DCase则是酶法中的一个关键酶，但当前自然筛 2 实验方法 [5] 选出来的菌株产酶活力较低 ，于是不少研究者纷纷 2. 1 酶活测定 转入基因工程方向进行改进。本文对一株产DCase基 取3个100mL的三角瓶，一个空白，两个作样 因工程菌的产酶条件进行了优化。 品。各瓶中分别加入9 mL底物，33℃ 预热5～ 1 材料与方法 1. 1 实验仪器 余两个各加入发酵液1mL，开始（33℃）进行酶促反 离心机（上海安亭科学仪器）；超声波细胞粉碎机 应，以上3瓶摇匀在33℃水浴上振荡30min后，立即 （宁波新芝生物科技股份有限公司）；高压液相色谱仪 加入6mol/L的HCl3滴，终止反应。于4000r/min （戴安DIONEX）；高档精密pH计（上海梅特勒－托利离心10min，