克隆新基因cDNA全长的策略和方法.pdfVIP

国外医学遗传学分册　2002年　第25 卷　第 1期 ·11 · [16]　Wolf I et al . Cancer Genet Cytogenet, 2000, 123: 128-132. [19]　Gray CP Cell Mol Life Sci. , 1999, 56:779-787. [17]　Tsou . J Burn Care ehabil, 2000, 21(6) :541-550. [20]　Lemonick MD. Time. 2001, 157:58-66. [18]　Joki T.N eurosurgery, 2001, 48: 195-201. cDNA ( , 150086) : 克隆新基因及获得其cDNA 全长是现代生命科学中研究基因功能的重要前提。随 分子生物学技术的迅速发展, 克隆新基因的技术也不断得到发展和完善, 尤其是生物技术与信息技术的结合和应用, 计算机克隆基因开始兴起。本文介绍 几种近年常用的克隆新基因cDNA 全长的方法、原理及其优缺点。 : cDNA ; cDNA ; ACE; : Q785　: A　: 1001-1048(2002) 01-0011-03 　　从20 世纪70 年代开始, 由于限制性内切酶的 新基因, 克隆新基因技术的发展。 发现,质粒等载体的应用,推动了DNA 体外重组技 1. 1cDNA : ACE 术的发展,使基因克隆成为可能。同时, 随 分子生 快速扩增cDNA 末端法(rapid amplification o 物学技术的迅速发展, 寻找新基因和克隆新基因的 cDNA end, ACE), 只需知道m NA 内很短的一 方法也不断得到发展和完善, 不仅能用来克隆已知 段序列即可扩增出其cDNA 的5′(5′ACE)或3′端 基因, 而且可以克隆一些未知的新基因。人类基因 (3′ )[1,2] 。该法的主要特征是利用一条根据已 ACE 组计划的提出和实施,使一系列寻找新基因的方法 知序列设计的特异性引物和一条与m NA 的 应运而生。在众多的方法中, 以消减杂交、 差 m NA ( 3′ )或加至第一链 3′端的同聚 polyA ACE cDNA 异展示、cDNA 的代表性差异分析法、消减抑制杂 尾( 5′ )互补的通用引物, 由于同聚体并非良 ACE 交、差异消减展示等为新近发展起来而且广泛应用 好的PC 引物, 同时为了便于 ACE 产物的克隆, 的方法。虽然这些方法以各自独特的设计策略, 方 可向同聚体引物的5′端内加入一内切酶位点。所用 便有效地寻找出一些差异表达序列,但这些表达序 的 模板可以是用多聚 引物延伸合成(3′, cDNA dT 列往往不是完整的基因, 而仅仅是基因的部分片 5′- ACE 均可) 。当 ACE PC 产物为复杂的混合 段, 因此,所有定位克隆的一个共同下游操作是如 物时, 可取部分产物作模板, 用另一条位于原引物 何从这个基因片段出发获得完整的基因克隆, 并测 内侧的序列作为引物与通用引物配对进行另一轮 定其全序列。目前比较可行的、应用得比较多的主 PC (巢式PC ) 。早在1988