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病毒性脑炎多重RT-PCR论文 【提示】本文仅提供摘要、关键词、篇名、目录等题录内容。为中国学术资源库知识代理，不涉版权。作者如有疑义，请联系版权单位或学校。 【摘要】目的利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立一种能够同时检测脑炎相关的8种虫媒病毒的多重逆转录-聚合酶链反应(mRT-PCR)方法,并对此方法作出初步评价。方法以脑炎相关的8种虫媒病毒为研究对象,包括版纳病毒(Banna virus,BAV),乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV), Tahyna病毒(Tahyna virus,TAHV),辽宁病毒(Liaoning virus,LNV),科萨努尔森林病病毒(Kyasanur forest disease virus,KFDV),辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)及云南环状病毒(Yunnan orbivirus,YUOV)并加入小鼠脑脊髓炎病毒(Theiler’s Mouse Encephalomyelitis virus, TMEV)做为内部对照。利用GeXP系统建立多重RT-PCR检测方法,设计各病毒特异引物并进行筛选,以病毒分离培养物和阳性标本来验证引物及多重反应体系的特异性,根据PCR结果来优化多重反应体系及反应条件,构建单克隆质粒并进行体外转录并制备标准品即体外转录RNA的梯度稀释液来检测多重体系的灵敏度。用该方法对未知标本进行检测,并将检测结果与其它方法进行比较,根据比较的结果对该方法做出评价。结果筛选后的各病毒引物扩增片段大小与设计相符且特异性强,相互之间无交叉反应。优化后的多重检测体系,可扩增出各病毒对应的特异片段,可在102拷贝/μL水平同时并特异地检测出8种(共13个特异片段)脑炎相关虫媒病毒RNA。通过对37份蚊虫碾磨液提取核酸的标本检测,可看出GeXP多重检测方法特异性强,且灵敏度明显高于病毒分离及半巢式PCR。结论成功建立了一种基于GeXP的多重RT-PCR技术平台的8种脑炎相关虫媒病毒的检测新方法,该方法具有高通量、灵敏度高、特异性强且快速等优点,对病毒性脑炎的分子诊断及流行病学调查具有重要意义。 【关键词】GeXP系统；病毒性脑炎；多重RT-PCR； 【篇名】GeXP多重RT-PCR技术在病毒性脑炎病原检测中的应用 【目录】GeXP多重RT-PCR技术在病毒性脑炎病原检测中的应用 摘要 5-6 Abstract 6-7 插图或附表清单 11-12 注释说明清单 12-14 引言 14-17 1 研究背景 17-21 1.1 GeXP系统的原理及应用 17-19 1.2 病毒性脑炎研究进展 19-21 2 病毒性脑炎GeXP多重检测体系的建立 21-43 2.1 试验材料 21-22 2.1.1 病毒来源 21 2.1.2 主要试剂 21 2.1.3 主要仪器耗材 21-22 2.2 缓冲液及细菌培养基配置 22 2.2.1 核酸电泳缓冲液 22 2.2.2 细菌培养基(LB培养基) 22 2.3 试验方法 22-33 2.3.1 引物设计 22-23 2.3.2 病毒样品处理 23-24 2.3.2.1 病毒核酸提取前准备 23 2.3.2.2 核酸提取 23-24 2.3.3 单引物特异性验证 24-25 2.3.4 构建单克隆质粒 25-27 2.3.4.1 PCR产物纯化 25 2.3.4.2 连接 25-26 2.3.4.3 转化 26-27 2.3.5 质粒的提取及线性化 27-29 2.3.5.1 质粒提取 27-28 2.3.5.2 提取质粒线性化 28-29 2.3.6 参考品的制备 29-31 2.3.6.1 体外转录RNA的制备 29 2.3.6.2 体外转录后去DNA模板 29-30 2.3.6.3 体外转录后去盐类及核苷酸 30-31 2.3.7 多重检测体系的建立 31-32 2.3.7.1 多重体系特异性验证 31-32 2.3.7.2 多重体系多引物单模板灵敏度分析 32 2.3.7.3 多重体系多引物多模板灵敏度分析 32 2.3.8 GeXP多重体系验证 32-33 2.4 试验结果 33-43 2.4.1 引物设计 33 2.4.2 单引物特异性验证 33-34 2.4.3 质粒的提取及线性化 34-36 2.4.4 多重体系特异性验证 36-37 2.4.5 多重体系多引物单模板灵敏度结果 37-40 2.4.6 多重体系多引物单模板灵敏度结果 40-41 2.4.7 多重体系验证结果 41-43 3 实验讨论 43-45 结论 45-46 参考文献 46-50 附录A 50-61 后记或致谢 61-6