第三章基因工程载体.pptVIP

氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素存在时，松弛型质粒可继续扩增，其拷贝数可达2000-3000个，称氯霉素扩增效应 基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。 5.根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 PUC载体的优点： a 具有更小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达500-700个拷贝 第二节 噬菌体或病毒DNA 一、大肠杆菌的λ-噬菌体DNA （2）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需基因 λ噬菌体基因大致分为4个区： 3、感染周期（溶菌循环） 4、溶源状态的建立 超感染免疫性 插入型载体（insertion vector） 取代型载体（substitution vector） 删除重复的酶切位点:野生型λDNA链上有 5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重 组操作，必须删除至1-2个. 为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还 需要增加一些单一的酶切位点. 3、灭活某些与裂解周期有关的基因 将无义突变引入噬菌体裂解周期所需的基因， 如将头部包装蛋白基因的CAG突变成UAG。这些 噬菌体只能在具有特异校正基因编码产物的菌株内 繁殖。 当这种λDNA进入一般大肠杆菌菌株后，不能合 成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细 菌，可阻止有害重组体的生物污染及扩散。 (1)免疫功能失活标记 (cI筛选) 加装选择标记cI基因 cI基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。 含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶源状态，细菌生长缓慢，形成混浊斑； (2)加装选择标记lacZ（蓝白斑筛选） lacZ基因编码β-半乳 糖苷酶，能催化无色的 X-gal生成蓝色化合物。 当外源基因插入到lacZ 基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物； 而空载体λ-DNA则产 生蓝色透明斑。 （三）λ-DNA作为载体的优点 可在体外包装成噬菌体颗粒，高效转染大肠杆菌 λ-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒 的装载量重组λ-DNA分子的筛选较为方便 重组λ-DNA分子的提取比质粒容易. 练习题 1.列举质粒载体必须具备的基本特性。 2.某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因 内有一Bgl I的切点。现用 Bgl I切割该载体进行基因克 隆，问（1）涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的 菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选 到含有插入片段的重组体? 3.YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大 片段时，YAC具有优越性? 4.如何将野生型的λ-噬菌体改造成为一个理想的载体? 5.什么是蓝白斑筛选法和c I 筛选法? 在克隆载体基础上，为使插入的外源DNA片段有效转录翻译成多肽，装有强化外源基因表达的强启动子以及利于表达产物分泌、分离和纯化的元件，这种载体称为表达载体。 cos site-carrying plasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。 由于λ-DNA包装蛋白只识别粘性末端的一小段顺序cos区。将这段DNA与质粒连在一起，构 建的重组质粒，可装载外源DNA（45.5kb)，它仍可象λ-DNA一样，在体外被包装成有感染 活性的噬菌体，进入细胞后，要通过质粒上的复制子进行复制。柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和COS位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有5～7kb左右。因此，柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。 应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做柯斯克隆。 这种技术的理论依据是，在线性λ噬菌体DNΑ分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端（cos位点）。在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系（site-specific cutting system），叫做末端酶（terminase）或Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。只有在被作用的λDNA分子具有两个cos位点，而且它们之间的距离保持在38～54kb的条件下，Ter体系才能对它们发生作用。 　　应用柯斯质粒作载体进行基因克隆的一般程序是：将外源DNA片段与柯斯质粒线性DNA分子进行体外连接反应。由此形成的连接产物群体中，有一定比例的分子是两端各有一个cos位点的长度为4