米曲霉的蛋白酶活力测定：.doc

米曲霉的蛋白酶活力测定： 紫外分光光度法： 0．4mol/L三氯醋酸溶液：称取三氯醋酸65.4g，定容至1000ml。 pH7.2磷酸缓冲溶液：称取磷酸二氢钠31.2g，定容至1000ml，成0.2mol/L溶液（A液） 称取磷酸氢二钠71.63g，定容至1000ml，成0.2mol/L溶液（B液）。取A液28ml和B液7.2ml，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol/LpH7.2的磷酸缓冲溶液。 2％酪蛋白溶液：称取酪蛋白2g，加入0.1mol/L氢氧化钠20ml，在水浴中加热溶解（必要时用小火加热煮沸），然后用pH7.2磷酸缓冲液定容至1000ml即成。配置后应及时使用或放冰箱保存。 蛋白酶活力测定：取试管两只，编号1，2，3，每只试管加入样品稀释液1ml，置于40度水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白5ml，精确保温10min。时间到后，各管立即加入0.4mol/L三氯醋酸5ml，以终止反应。继续水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心分离或过滤。取滤液用751分光光度计在275nm处测定其吸收度。 空白实验也是取试管3支，编号 ，测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯醋酸5ml，使酶失活，在加酪蛋白。为了清楚起见，参看下表： 试剂 管号 对照 1 2 3 （1） （2） （3） 预热酶液 1 1 1 1 1 1 三氯醋酸 0 0 0 2 2 2 预热2％酪蛋白 2 2 2 0 0 0 40度下作用10min 三氯醋酸 2 2 2 0 0 0 预热酪蛋白 0 0 0 1 1 1 40度下作用20min，滤液测定 A值 净A值 平均净A值 计算：在40度下每1min水解酪蛋白产生1Ug酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。 蛋白酶活力单位＝A/10× 11×N