第7章 重组DNA药物.ppt

第七章 重组DNA药物 一、重组DNA技术与基因工程的基本定义 优点： 1、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽；去除内源性物质的不足之处 2、提供足够数量的生理活性物质，以进行生理生化、结构的研究 3、利用基因工程技术可发现、挖掘更多内源性生理活性物质 4、获得新型化合物 主要基因工程产品的研制、开发、上市时间 DNA重组药物制造的主要步骤 二、基本过程 上游阶段： 实验室 获得目的基因、酶切和酶连、插入适当载体、转入宿主细胞、复制、目的基因分析确证、表达、筛选合适表达系统等 下游阶段：将实验室成果产业化 发酵参数确定、新型生物反应器研制、高效分离介质及装置开发、生物传感器设计制造、电子计算机优化控制、产品质量控制 注意：上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现和保证，这是基因工程产业化的基本原则。 1、目的基因的获得 1）、鸟枪法（基因文库） 基因组DNA提取→ 限制性内切酶部分水解→与载体连接→转化、扩增与筛选 2）、逆转录法（cDNA文库） mRNA纯化→cDNA第一合成→第二链合成→ cDNA克隆→将重组体导入宿主细胞→ cDNA文库鉴定→目的cDNA克隆的分离和鉴定 3）、合成法 4）、PCR法 4、PCR法或逆转录PCR（RT-PCR） 典型PCR反应包括 ①模板变性 94℃以上（1～2′） ②退火 50～55℃（1～2′） ③延伸 72℃（1～2′） 在高温聚合酶作用下， 以DNA单链为模板， 由引物起始从5′→3′ 延伸。 化学合成法 在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在 60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。 2、基因表达 1）、选择宿主细胞 原核 大肠杆菌：生长快；遗传研究深入；产品多为胞内（包含体）或周质中；不能糖基化修饰。需注意内毒素污染。 枯草芽孢杆菌： 分泌力强，不形成包含体；不修饰；胞外酶可能会降解产物 链霉菌：分泌能力强；不致病，安全；有糖基化能力。 优点：易大量生产，成本低，周期短 缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性 真核 酵母：研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物；基因组小，仅为大肠杆菌4倍；传代时间短；无毒；有分泌功能和修饰功能；已用于干扰素、乙肝表面抗原等重组DNA药物的生产。 丝状真菌：有很强的蛋白质分泌能力，能正确加工，糖基化方式与高等生物相似，有成熟发酵和后处理工艺 哺乳动物细胞：类似天然产物，但培养条件苛刻 2）、表达载体 要求： a、能独立复制 b、有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记 c、具有有效运载外源基因的能力，能携带大小不同的外源基因 d、容易控制，在细胞内稳定性高，安全可靠。 如大肠杆菌的pBV220系统，为温度诱导表达载体，已成功用于IL-2，IL-3，IFN等 pET系统，最有潜力的系统，可用乳糖代替IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖），产物可达细胞总蛋白20~30%，表达量可达总蛋白50%。 pET载体 3）、构建工程菌 目的基因与载体DNA的连接 重组DNA向宿主细胞内转移 筛选与鉴定带有目的基因的阳性克隆 影响目的基因表达的因素 四、质量控制 1、原材料质量控制： 2、培养过程质量控制 3、纯化工艺质量控制 4、目标产品质量控制 保证编码DNA序列正确 要了解以下特性： A、目的基因来源、克隆过程、序列 B、表达载体名称、结构、遗传特性及酶切图谱、抗生素标记等 C、宿主名称、来源、传代历史、检定结果及生物学特征 D、载体引入宿主方式、及载体再宿主中状态 E、插入基因于表达载体两侧控制区核酸序列 F、启动和控制克隆基因表达的方法及水平 种子克隆纯而且稳定，在培养工程中工程菌不应出现无突变或质粒丢失的现象 种子批系统 工作细胞库 尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白等杂质，并避免在纯化过程带入有害物质 纯化每一步应测定纯度、计算提纯倍数、收率等等 1）、产品的鉴别 氨基酸组成分析： 肽图分析： N末端和C末端氨基酸测序： 蛋白质二硫键的分析： 重组蛋白相对分子量： 等电点的测定： 2）、纯度分析：SDS, CE, IEF, HPLC 3）、生物活性测定 4）、残余杂质检测 宿主细胞蛋白含量、宿主细胞DNA、残余抗生素等 5）、安全性检测 无菌实验、热原实验、毒性实验、免疫原性检查 A 体内生物学活性测定