浙江大学生物化学实验甲 聚丙烯酰胺凝胶等点聚焦电泳.docVIP

聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳原理 一、蛋白质等电点的概念及性质 1、蛋白质等电点（pI）的概念 当蛋白质主要以两性离子形式存在时所处溶液的pH值。各种蛋白质由不同种类的氨基酸以不同的比例组成, 因而有不同的pI, 是其固有的物理化学常数。 当pH＞pI时，蛋白质带负电荷, 在电场作用下向正极移动； 当pH＜pI时，蛋白质带正电荷, 在电场作用下向负极移动； 当pH=pI时净电荷为零, 在电场作用下既不向正极也不向负极移动。 二、聚丙烯酰胺凝胶等点聚焦电泳的原理 利用各种蛋白质pI的不同, 以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物, 并在其中加入两性电解质载体(脂肪族多氨基多羧酸的混合物), 在电场作用下, 蛋白质在pH梯度凝胶中泳动,当迁移至其pI的pH处, 则不再泳动, 而浓缩成狭窄的区带, 这种分离蛋白质的方法就称为等电聚焦电泳(IEF)。 pH梯度的形成常采用“自然pH梯度”。即利用一系列两位电解质载体在电场作用下, 按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH 梯度。在此pH梯度中,各种蛋白质迁移到各自的pI处时就不再移动, 而得到分离。见图： 当利用IEF分离蛋白质并测定pI时可先选用pI3-lO的两性电解质载体及同一范围的标准pI蛋白, 将其与未知样品同时电泳, 固定染色后, 就可以pH值为纵轴, 距阴极迁移距离 (cm)为横轴作出pH梯度标准曲线，见图： 根据染色后未知蛋白质迁移距离即可推知其pI，为进一步精确测定未知物的pI, 还可选择较窄范围的两性电解质进行电泳, 以提高分辨率, 得到更准确的pI。如实验时无标准pI蛋白质作标定依据, 则电泳后立即用表面微电极每隔0.5cm直接测定胶板的pH值,制作pH梯度曲线, 染色后根据迁移距离推知某种蛋白质的pI。 IFE操作简单,只要有一般电泳设备就可进行,电泳时间短,分辨率高,应用范围广, 可用于分离蛋白质及测定pl,也可用于临床鉴别诊断, 农业，食品研究, 动物分类等各种领域。随着其他技术的不断改进, 等电聚焦电泳也不断充实完善, 从柱电泳发展到垂直板,又进而发展到超薄型水平板等。