去细胞异种神经复合骨髓基质干细胞修复神经缺损实验的研究.pdfVIP

第四届中华骨科杂志论坛天津·2012 去细胞异种神经复合骨髓基质干细胞修复神经缺损的实验研究 内古医学院第二附属医院手显II科呼和浩特市010030 尚 温树正王继 东升 增 云 杨晨 周围神经缺损的修复一直是外科领域致力解决的难题之一。近年来，随着组织工程学与转化医学的快 速发展，组织工程神经为神经缺损的修复提供了新的修复 路，大量文献报道，同种异体去细胞神经基膜 管修复神经缺损已取得了较满意的效果，但供体紧缺，这促使我们进行异种去细胞神经移植的尝试。本课 题通过设计BMSCs复合AXN构建组织工程神经修复周围神经缺损的实验研究，去探讨一种更新的、更有价 值的周围神经缺损的修复路。 材料与方法 一、AXN的制各及免疫学检测 和免疫学检测。 二、BMSCs的培养、鉴定、标记并与AXN复合 手术抽取Wistar大鼠红骨髓，采用全血培养法进行BMSCs的培养，通过生长特性观察及细胞表型检 II 液一同加入终浓度为10mol／LBrdU溶液，孵育48h后取出爬片固定，避光HE染色，光镜结合免疫荧光 显微镜40倍视野下观测BMSCs核的BrdU标记情况，在显微镜下随机选取10个非重叠的视野进行计数， 阳性率=阳性细胞数／视野总细胞数×100％，计算标记的阳性率。将制备好的AXN置于含10％胎牛血清的 培养液)注入到AXN内，在等浓度细胞悬液中混合培养24h后手术移植到大鼠坐骨神经缺损处，部分组织 避光、4％多聚甲醛固定24h，包埋、切片，免疫荧光显微镜下观察细胞复合情况。 三、建立缺损神经缺损模型及实验分组 单纯AXN修复神经缺损；C对照组：自体神经移植。手术于自梨状肌下缘切断右坐骨神经造成lOmm缺损， 手术切去的神经组织以4％多聚甲醛固定。10-0尼龙线显微镜下4针等间距缝合神经外膜神经外膜，A、B 实验组选用对应移植物，C对照组将截取的自体神经远近端翻转后原位吻合神经外膜。以上步骤结束后， 抗生素生理盐水冲洗手术操作区域，分层缝合，抗生素手术野浸润注射，术后大鼠分笼饲养，通过对动物 一般情况观察、免疫学检测、肌电生理检测、组织取材形态学观察等来评价神经修复效果。 四、统计学处理 各组数据用x±s标准差表示，采用SPSSl4．0软件进行t检验，P0．05认为差异有统计学意义。 结果 AXN形态学观察及免疫学检测：AXN呈乳白色略透明的圆柱状外形，两端无出的轴突髓鞘。其外 径及长度无明显改变，神经的延展性略有增加，神经外膜的韧性、弹性与新鲜神经基本一致髓纵切片见 红染的神经膜波状排列，空隙内无任何细胞结构和组织碎片；SEM显示神经的细胞成分、轴突及髓鞘消 失，而管状SCs基底膜保留完好(图1a、b)，流式细胞仪删C—II检测结果经统计分析结果显示：新鲜神 组间有显著性差异(t=8．459，P0．05)，说明AXN较新鲜神经免疫原性明显降低。(表1) 第四届中华骨科杂志论坛天津·2012 一、踟SCs的培养、鉴定、标记及与BMSCs-AXN复合情况观察 良好，符合BMSCs特性。BrdU标记BMSCs48h后，镜下见细胞生长良好，融合达80％，胞核阳性标记率达 88．36％(表2)(图2 观察见AXN波状排列的纤维间隙内散在着BrdU-BMSCs。 二、术后动物坐骨神经修复效果评价 术后所有动物患肢感觉、运动功能全部丧失，饲养过程中无一例死亡，手术切口无感染发生，创 口一周后愈合。术后2w部分实验动物开始足底皮肤干燥，出现 ，针刺反应无，4w外周血CD3+、 CD4+、CD8+T细胞增殖三组间无明显差异(表2)。12w时A、C组足底全部愈合，针刺反应明显， 患肢足趾经可以伸展。肌电刺激移植段近侧神经，于胫骨后肌群可记录到运动诱发电位，与对侧正 常神经比较，其潜伏期延长，波幅较低；根据神经传导速度=传导距离／潜伏期所得数值经单因素方差 显著性差异(PO．05)。 术后4周免疫组化染色见各组移植段内均有细胞生长，以A、C组细胞量较多且排列较整齐，类 吻合口。 术后12w，SEM观察移植段神经内均可见SCs一轴突复合体，A、C组再生神经纤维数目多，神经纤维粗大， 束间结缔组织少再生髓鞘内板层致密，髓鞘明显增厚(图4a，b)，B组纤维断面形态不规则，髓鞘层次紊乱， 束间可见增生的结缔组织。小腿三头肌纤维染色见AC组肌