剪切力诱导微血管内皮细胞形态学改变及信号转导机制的初步的研究.pdfVIP

剪切力诱导微血管内皮细胞形态学改变及信号转导机制的初步研究 胡金麟 常小飞2宋晓燕2李玉珍 宋欣 (中国人民解放军总医院病理生理学研究室北京100853) (2北京工业大学生物工程中心 北京100022) 血管的腔侧面被覆一层内皮细胞，血液流动对其形态学及功能都有一定的影响 0-71，但已有的报道主要研究剪切力对大血管内皮细胞形态、功能的影响，对微血管 内皮细胞在剪切力作用下的形态、功能、代谢等方面改变的研究尚少见报道。我们利 用自行设计的剪切力流动小室对大鼠脑微血管内皮细胞在剪切力作用下的形态学改 变进行了初步研究，在此基础上又进行了剪切力对内皮细胞骨架蛋白结构作用的研 究，取得了有益的结果，为进一步开展剪切力对微血管内皮细胞功能、代谢等方面的 影响提供了实验数据。 1材料和方法 1.1脑微血管内皮细胞的培养 一月龄雄性SD大鼠(本院动物中心提供)，6%水合氯醛腹腔麻醉。断头后无菌条 件下剥离软脑膜及肉眼可见的大血管，去除大脑白质及小脑，收集大脑皮质，充分剪 碎、匀浆，参考文献[I〕方法培养内皮细胞至细胞长成融合单层。待细胞融合达80% 后消化传代于8mmXSmm的盖玻片上，传代后4-7天左右用于实验。 1.2剪切力流动小室的制作 参考Stephen-G等人3[[,-68,11〕的实验装置并加以简化改进，系统的具体结构见文献 (1-21 对于平板槽流，剪切力占流量Q及流室几何尺寸的关系为: :_6丝 (1) wh2 式中:71为循环液粘度，Q为循环液流量，、为流室宽度，h为流室高度。 在本实验中rF0.75mPa.s,w=1.35cm,h=0.04cm，因此剪切力T-,}流量Q的关系 为: :=0.3472Q (2) 单位:::dyn/cmz,Q:ml/mino 1.3实验系统的构成 整个实验系统由流动小室、恒流泵、医用硅胶管道、储液瓶构成。灌流液由恒流 泵泵出后经管道流入流动小室，对内皮细胞施加剪切力，再经管道回到储液瓶中。整 套系统置于37℃恒温的50/aCOZ培养箱中。灌流液使用无血清的DHanks液，从冰箱 中取出后先置于37℃恒温的C02培养箱中过夜，然后使用。 国家自然科学基金资助项目(N0 1.4实验设计 原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞传代于。.8X0.8cmz的盖玻片上，7天左右细 胞铺满。将盖玻片放在流动小室中进行实验。通过控制循环装置流量的大小调节作用 于细胞上剪切力。本实验所用剪切力分别为0.17,0.35,0.70和1.41dyWc扩，作用 时间分别为30min,1h,3h和6h.剪切力作用后在倒置及荧光显微镜下观察细胞形 态学及细胞骨架蛋白的改变并照相分析。 1.5考马斯亮蓝显示内皮细胞骨架的方法 参考鄂征等人的方法[[13]并加以改进，方法参见文献13% 1.6F-Actin的标记 参考鄂征等人的方法[(131并加以改进，方法参见文献[11 1.7c-fos蛋白染色方法 c-Fos蛋白免疫组织化学染色用TBD公司c-Fos免疫组织化学试剂盒。实验在 37℃条件下进行。具体染色方法参见文献[21 1.8K+通道电流测定方法 膜片钳放大器(EPC-7,List-medical,Gemiany);LabmasterTL-1接口(Axon Instrument,USA)，相差显微镜(Nikon810185,JAPAN)，热抛光仪((NarishigeMF-83, JAPAN),硬质玻璃毛坯(中国科学院微电子所);386微机(IBM),pH计(5986-25型， Cole-parmerChemcadel)，电子天平(Sartorius,USA),，巨温水浴(LH586-1，上海沪西仪 器厂)。 培养的内皮细胞经0.04%的胰酶IEDD、消化约5分钟，待胞体变圆，表面隆起时 用细胞外液洗去胰酶，终止消化。玻璃微电极尖端直径为1--2[1m，冲灌电极内液后阻 抗为2-5MSJ。将培养皿置于倒置显微镜台上，选定目标细胞，用液压微操纵器将微 电极贴于细胞表面