PCR技术和Bt+ICP基因的鉴定.pdfVIP

、， 曲 8 植枷保护2l世纪展望 (：正Z’ I CP基因的鉴定 ／～。POR技术与Bt 张∥杰 宋福平 (中国农业科学院檀物保护研究所．植物瘸虫害生物学国家重点实验室 北京 100094) cu，基因分离 摘要本文从介绍通要的杀虫微生物一帆的Ic心|剐研究现状人手，结台Bt 克降的进展，重点介缁了近年来县确嫒人影响的lOfh?cR鉴定方法，并加以分析、比较，提出 了适台我国国情的研究方法干¨思路。 关键词Btfw基旧E：R基曰鉴定 苏云金芽孢杆菌(Bacillus ({nsecticidalcryst,alprotein，ICP)，对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、膜翅 目等节肢动物，以及动植物线虫、蜱螨等都具有特异性的毒杀活性，而对非目标生物安全。 半个世纪以来已广泛应用于全球的多种农业和林业害虫的生物防治。198]年Schnepf克隆 了第一个杀鳞翅目害虫的Bt杀虫蛋白基冈，从此，分离克隆新的ICP基因成为国际上Bt 研究新的热点。为了在研究、，j：发和应用等方面领先，目前各困都在竞相寻找对新的害虫 有活性的Bt菌株及丰H关的特异性新基因，如对线虫．蚂蚁、虱具有活性的瓤的flt菌株或 杀虫蛋白基因．近年相继发现矛If分离。 从Bt菌株中克隆新基因，首先要确定菌株中听含有的基因类型。80年代初期的方法 只能是先克隆基因，再通过活性分析和序列{911【定来确定。尽管后来使用了Southern杂交、 酶联免疫、杀虫生测等方法进行Bt基因的鉴定，仍然耗时、费力，十分烦琐。PcR技术以 其快捷、灵敏、准确等特点已广泛地应用{：生物、医学等领域，近年来被尝试用于Bt菌 年，仅3年的时问，分离克隆的新Bt基因多达44种。取得如此陕速进展的重要原因应当 归功于PCR技术的应阚。 l研究进展 1991年，美国ClBA—Gei 基因的鉴定和杀虫活性预测。他根据当时已公布的基因序列设计了12条特异性引物，用 并根据鉴定的基因型对菌株杀虫活性进行预测。预测结果与实际生测结果相符。 1993年，PCR技；忙用于Bt基因的鉴定在国外不同的实验室都取得很大进展，并在研 究方法上有所突破。F{本北海道大学的浅野真一郎根掘crylI基因的保守区设计了寡核营 酸引物，PCR扩增之后，用限制性内切酶消化扩增产物，根据酶切片段长度差异，即可鉴 ． 定crylM、cryllB基因。 张杰等：PCR技术与BfICP基f^J的鉴定 Primer 用于鉴定已商品化的Bt菌株。含有已知基田的Bt菌株PCR扩增产物的分布范围是从2jo～ 1500bp，依此作为判断的标准。 中的crytAa、Ab和爿c3种基因。这种方法将PcR技术的快速，特异和规模充分体现d。束。 1994年哥伦比亚和墨西哥学者发表了用FCR方法鉴定Btcry／类基因的文章，这种快 捷方便的研究手段已为越来越多的人所接受。他们合成了．13条与cry基因高度同源的引 这种方法只需两个反应，每个反应加6～8种引物，通过电泳即可区分菌株所含有的cryl 基因型。用上述方法作者鉴定了11株来自墨西哥的BZ分离株。因此作者认为鉴定Bt菌 株资源的基因型，对于研究Bt在自然界的分市、进而充分开发和利用都有重要价值。 哥伦比亚和墨西哥学者的研究工作不断深入。1995年，根据cry基因的保守区他们设 计合成了用于鉴定cryl和crylH基因的通用引物各一对，根据cw基囡的可变区设计合成 了特异性引物∞，6对，cTy))l 因扩增产物范围是211～769bp。整个鉴定_[作需要两步完成，能够鉴定当时已公布的所有 PcR扩增能产生与预期结果不同的片段，井 c删、c，yBI基因。在此项研究中，作者发现r 推测可能含有新基因。这种方法用于鉴定已知基因是准确