现代色谱分析HPLC2.ppt

医药色谱理论与实践 高效液相色谱法 离子对色谱法 将离子对试剂加入到含水的流动相中，用以分离离子型或可离子化的化合物的方法称为离子对色谱法（ ion pair chromatography,IPC或PIC)。现在主要采用疏水键合相为固定相，称为反相离子对色谱法（Reversed-phase ion pair chromatography，RP-IPC)。 离子对色谱法分离机制 离子对模型 动态离子交换模型 离子相互作用模型 离子对模型 试样离子在流动相中与离子对试剂生成不带电荷的疏水性离子对，然后溶解或吸附在疏水固定相上。离子对试剂的烷基链越长，生成的离子对与反相键合相的亲和力越大，组分的k值越大。 动态离子交换模型 离子对试剂在流动相中溶解后，疏水的反离子被吸附在固定相上，形成动态覆盖的离子交换剂，通过离子交换反应而使组分保留在固定相上。离子对试剂的烷基链越长，越易被固定相表面所吸附，则其交换容量越大，样品组分的k值也越大。 离子相互作用模型 离子对试剂被吸附在固定相表面形成动态双电层。在固定相表面均匀排列，但只覆盖很少一部分表面，大部分固定相表面仍为非极性的键合烷基，样品组分的保留值由双电层的静电作用力和固定相表面的非静电作用力所决定。由于离子对试剂在流动相和固定相间存在动态平衡，因而流动相中离子对试剂的浓度越大，或离子对的烷基链越长，吸附在固定相表面的离子对试剂的浓度越大，则电荷密度越高，因此样品组分的k值也越大。 反相离子对色谱法条件选择 1.离子对试剂的选择 分析酸类或带负电荷的物质时，常用季铵盐作离子对试剂；分析碱类或带正电荷物质时，常用烷基磺酸盐（或硫酸盐）作离子对试剂。 常用的离子对试剂 反相离子对色谱法条件选择 2. pH值选择 由于离子对的生成依赖于样品组分的离解程度，当样品组分与离子对试剂全部离子化时，组分的k值最大。因此调节pH值可在较大范围内改变弱酸和弱碱样品的保留值和选择性，对强酸、强碱组分的影响较小。pH值的选择还应考虑固定相的适用范围。 离子抑制色谱法 通过改变流动相的pH值，抑制弱酸或弱碱的离解 ，使其以原形参与分离过程。 所以，分析弱酸时常在流动相中加乙酸、磷酸等，而在分析弱碱时常加入二乙胺等。 手性色谱法 背景知识 手性药物，60％以上为外消旋体给药。 由于生物系统（酶、受体、载体蛋白等）是一手性体系，导致对映异构体生物活性的显著差异，以及在分布、代谢和排泄方面的差异。所以，手性对映体的研究成为当前医药领域的热点之一。 FDA和欧共体已经要求在申报新药时，提供对映体的资料。 HPLC拆分法 手性固定相法（Chiral Stationary Phase, CSP） 手性流动相添加剂法(Chiral Mobile Phase Additives,CMPA) 手性衍生化法（Chiral Derivatization Reagent,CDR) 手性固定相法（CSP）－蛋白质固定相 所有蛋白质都是由L－氨基酸组成的聚合物，其一级结构中含有几百个手性中心，其二级和三级结构使手性上升到新的水平。这使得蛋白质具有手性固定相所需的性质。 现已应用于手性拆分的蛋白质 1. α1-酸糖蛋白（AGP） 一种人血浆蛋白，分子量大约40000，碱性药物的主要血浆结合蛋白。1983年由Hermansson首先报道 。1988年出现第二代AGP-CSP。 2. 卵类蛋白(ovomucoid) 1987年Miwa等从鸡蛋清中分离的糖蛋白。分子量约27000。 3. 血清白蛋白 人血清白蛋白（HSA)和牛血清白蛋白（BSA)，分子量超过6000。 手性固定相法（CSP）－环糊精手性固定相 环糊精（cyclodextrin,CD)是复曲面的环状寡糖，最常见的是由6，7，8个D-(+)-吡喃葡萄糖单位构成，分别称为α,β,γ环糊精。其中以β-环糊精最为常用。 手性固定相法（CSP）－手性聚合物固定相 此类固定相包括两类不同来源的聚合物：一类是天然的多糖衍生物（包括纤维素和直链淀粉 ），另一类是合成的高分子化合物。 纤维素和淀粉的手性识别能力来源于葡萄糖单元的手性。其优越性在于：稳定性好；制柱简单，无需键合，吸附在大孔硅胶上即可；适用于多种手性化合物尤其是芳香化合物的拆分，对醇、酸、酮、酯及含硫含磷化合物、金属有机化合物均有良好的手性识别能力。 合成聚合物中有聚酰胺类、聚氨酯类、聚甲基异丁酸酯等，它们的手性来源于聚合物的螺旋型结构。如具有螺旋链的三苯甲基丁烯酸酯类聚合物（Chiralcel-OT 或OP柱）对刚性平面结构的样品具有良好的立体选择性，适用于酯、烃类、酰胺等化合物的拆分。 手性固