自分泌型GRP78对肠癌细胞增殖影响和机制研究.docVIP

自分泌型GRP78对肠癌细胞增殖影响及机制研究 【摘要】：葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是存在于内质网中的一种热激蛋白,其主要作用是帮助新生多肽合成及组装,调控内质网应激反应。在肿瘤细胞中,GRP78常过表达并迁移到肿瘤细胞膜表面,膜上的GRP78作为信号分子受体,参与调控多种肿瘤细胞信号转导。例如,GRP78作为受体与活化的α2-巨球蛋白结合,激活PAK-2,同时将LIMK和人激动蛋白素磷酸化,导致肿瘤细胞迁移的能动性加强。此外,Cripto蛋白与细胞膜GRP78形成的复合体可以抑制TGF-β信号通路,促进肿瘤增殖。近年来的研究表明,实体瘤细胞在内质网应激条件下,会诱导GRP78高表达,并分泌到胞外,继而结合到内皮细胞的细胞表面受体。胞外GRP78通过激活ERK和AKT途径,保护血管内皮细胞抵抗硼替佐米的抗血管生成作用。本研究首次发现,人结肠癌细胞系可分泌GRP78到肿瘤微环境中,分泌的GRP78在胞外发挥信号因子作用。MTT实验结果表明,分泌型GRP78可以促进肠癌细胞增殖。通过质谱分析以及免疫荧光染色等方法,我们发现分泌型GRP78的作用依赖于和细胞表面受体--GRP78的结合。为了进一步了解GRP78复合物引起细胞增殖的机制,我们采用Westernblotting检测了与细胞增殖相关的p-Akt的表达水平,发现外源加入GRP78可以有效地提高p-Akt的表达水平,并活化PI3K信号通路。应用PI3K信号通路的抑制剂LY294002阻断该通路,可以看到GRP78引发的细胞增殖受到明显抑制。实验结果还表明,p-Akt的激活抑制了GSK3β的活性,同时活化了β-catenin,c-myc,cyclinD1等Wnt信号通路的核心蛋白及其下游增殖正调控因子。此外,我们还注意到,分泌型GRP78处理会引起丙酮酸激酶2表达量的升高,推测也是分泌型GRP78促进肿瘤恶化的原因之一。我们的研究结果提示,微环境中的.GRP78作为信号分子与其受体--肿瘤细胞膜表面的GRP78结合,促进肿瘤的生长及存活。以上结果表明,GRP78的分泌可能是肿瘤细胞适应微环境压力的一种应激方式。即微环境中的某些条件改变,如葡萄糖缺乏、缺氧,会导致GRP78细胞外分泌量的增加,分泌型GRP78的增加,促进了与细胞存活和细胞增殖的相关信号通路的高表达,以抵抗微环境的应激变化。【关键词】：分泌型GRP78细胞膜表面GRP78细胞增殖 【学位授予单位】：山西大学 【学位级别】：硕士 【学位授予年份】：2013 【分类号】：R735.3 【目录】：摘要10-11ABSTRACT11-13第一章文献综述13-251.1GRP78的分布及生物学功能13-171.1.1内质网GRP78及功能13-141.1.2胞浆GRP78及功能141.1.3线粒体中GRP78及功能141.1.4细胞核中GRP78及功能14-151.1.5肿瘤细胞表面的GRP7815-161.1.6肿瘤细胞分泌的GRP7816-171.2GRP78与肿瘤进程研究进展17-231.2.1实体瘤的进程需要GRP78的表达17-181.2.2GRP78促进肿瘤生长的机制研究18-191.2.3GRP78与肿瘤微环境19-211.2.4靶向GRP78敏化肿瘤治疗211.2.5GRP78与肿瘤微环境中异常能量代谢的关系21-221.2.6GRP78与肿瘤发生时Wnt信号通路激活相关22-231.3本研究目的意义23-25第二章结肠癌分泌型GRP78的检测及GST-GRP78的获得25-322.1实验材料25-262.1.1菌株、质粒与细胞株252.1.2试剂及抗体25-262.2实验方法26-292.2.1细胞的培养26-272.2.2细胞培养液蛋白提取及Westernblot272.2.3大肠杆菌DH5a、BL21感受态细胞的制备272.2.4细胞总RNA提取及逆转录27-282.2.5质粒的转化282.2.6pGEX-4T-2-GRP78重组质粒的构建282.2.7工程菌pGEX-4T-2-GRP78BL21的诱导表达28-292.2.8GST-GRP78融合蛋白的纯化292.3实验结果29-312.3.1结肠癌细胞系中分泌型GRP78的检测29-302.3.2重组质粒pGEX-4T-2-GRP78的构建302.3.3融合蛋白pGEX-4T-2-GRP78的表达纯化30-312.4讨论31-32第三章分泌型GRP78生物学活性研究32-363.1实验材料323.1.1细胞株323.1.2试剂及抗体323.2实验方法32-333.2.1MTT测定细胞增殖32-333.2.2细胞划痕实验测定细胞迁移333.2.3Westernblotting333.2.4统计学分析333.3实验结果33-353.3.1分泌型GR