实用色谱条件建立方法.docVIP

绪论 HPLC方法建立的步骤 有关样品的情况，明确分离目的 是否需要特殊的HPLC步骤，样品预处理等 选择检测器和检测器设置 选择液相色谱法；进行预实验；估计最佳分离条件 优化分离条件 检查出现的问题或所需的特殊步骤 7a.回收纯化的物质 7b.定量校正 7c.定性方法 8.论证方法使之进入常规实验室 1.2开始前应知道 1.2.1样品的性质 有关样品组分和性质的重要信息 ⑴所含化合物的数目； ⑵化合物的化学结构； ⑶化合物的分子量； ⑷化合物的pKa值； ⑸化合物的UV光谱图；⑹化合物在样品中的浓度范围； ⑺化合物的溶解度 1.2.2分离的目的 主要目的是定量分析？一种（不希望有的）物质的检出？未知样品组分的确认？还是纯化物质的分离？其它目的见第13章。 是否有必要解析出样品的所有成分？如可能有必要分离出产品中所有降解物或杂质，以使含量测定结果更加可靠，但却没必要将它们彼此完全分开。当证明仅用一种HPLC方法将样品分开有困难时，将样品组分分离通常会更容易些， 如要求定量分析，准确度与精密度需多大？精密度通常达±1-2%。 该方法应设计多少种不同的样品基质？特殊化合物可能会以不同的样品形式出现（如：原料药，一种或多种形态，环保样品等）。是否需要一种以上的HPLC方法？单一或类似方法分离不同形态样品是否理想？ 一次将分析多少样品？当一次分析的样品数目超过10个，运行时间一般应控制在20min以内。 即将使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？实验人员操作技能如何？色谱柱能否恒温？HPLC系统能否做梯度洗脱？该方法是否可在不同设计与生产的设备上运行，尤其是在哪些易造成柱外谱峰展宽的老型号仪器上运行？操作者具有什么经历和培训？ 1.3样品预处理与检测 样品来源形式不同，可能以如下形式出现： 可直接进样的溶液 需稀释，pH缓冲，加入内标或其它定容操作的溶液 必须首先溶解或提取处理的固体 样品预处理以除去干扰物和/或保护色谱柱或仪器不受损害 HPLC方法建立期间，在第一次进样前，应把握所选检测器能检测到所有的被测样品组分。 通常首选可变波长紫外（UV）检测器。 1.4建立分离方法 1.4.1选择HPLC分离模式与起始条件 哪种色谱模式用于该样品最有希望得到理想的结果？本书假设已选定HPLC分离模式，但对具体样品，应在对多种分离模式考察后再做决定。 若选定HPLC分离模式，下一步可将样品分为一般样品或特殊样品。一般样品为小分子（小于2000Da）典型混合物，用近乎标准化的起始条件即可分开。否则（或特殊样品时）特殊色谱柱和特定条件才能很好的分离，见表1-2。 表1-3总结了适合一般样品首次（反相）分离的实验条件。如样品为中性，一般不需在流动相中加入缓冲液或添加剂，但对于酸或碱性样品，通常需在流动相中加入缓冲剂。碱性或阳离子样品，推荐用“弱碱性”的反相色谱柱，流动相中加入胺添加剂可能对分离有利。首次实验完成后，再按下述讨论系统的加以进一步完善。 图1-3 利用样品的有关信息，选择初始实验分离条件 表1-2 特殊样品的处理 样品 要 求 无机离子 异构体 对映体 生物样品 大分子 检测为主要问题；实用离子色谱柱 有些异构体能用反相HPLC分开，可分为一般样品类中；用⑴正相HPLC或⑵环糊精-硅胶色谱柱的反相分离能较好的分离异构体（见第6章） 分离这些化合物需要“手性”条件；见第12章 多种因素如分子构象，极性官能团和宽范围的疏水性使这种样品很“特殊”，见第11章 “大”分子需要大孔径的色谱柱填料（远大于10nm孔径）；另外，生物分子（第11章）也需这种条件 表1-3 首次HPLC分离的较好实验条件 分离条件 较好的首要选择 色谱柱 尺寸（长度，内径ID） 粒度 固定相 15×0.46cm 5μm a C8或C18 流动相 溶剂A和B %B 缓冲液（化合物、pH、浓度） 添加剂（如胺改性剂、离子对试剂） 缓冲液—乙腈 80%-100% b 25mM磷酸钾，2.0 ＜pH＜3.0 c 开始时不用 d 流速 1.5-2.0mL/min 温度 样品大小 体积e 重量e 35-45℃ ＜25μL ＜100μg a 3.5μm微粒为另一选择（见第5章），用7.5 cm色谱柱。 b 用于初始等度分离；初始用梯度实验较好（见8.2.2节）。 c 中性样品不需缓冲液；如pH＜2.5，建议用pH稳定的色谱柱（见5.4.3.5）。 d 见9.1.1.3。 e 小体积色谱柱（如7.5×0.46cm，3.5μm）需要的量更小。 在图1-3首次实验的基础上，等度或梯度洗脱均可作为合适的方法（见8.2.2节）。这时，也可能明显的看到典型的反