游离整体细胞生物转化反应行为研究.pdfVIP

游离整体细胞生物转化反应行为的研究 王雪根徐虹欧阳平凯 (南京化工大学国家生化工程技术研究中心南京210009) 摘要本文对游离整体细胞(大肠杆菌)的生物转化行为，特别是在高浓度底物(富马酸铵)环境下的细胞形 态结构进考察，解释了高浓度底物，反应行为，细胞结构和细胞渗透化之间的关系． 关键词游离整体细胞高浓度底特细胞形态和结构渗透化 游离整体细胞直接作为催化剂来制造产品已有不少实例”。I，且在某种程度上比固定化细胞 更具优越性I；I，故游离整体细胞召酶工程中的应用也越来越得到有关人士的重视。为了使游离整 体细胞催化技术得到更好的应用。对游离整体细胞的基础研究是十分必要的，如细胞的渗透化【sl、 酶的胞内固定化13]、酶细胞在反应前后形态和结构变化等。文献在这方面的报道很少。本文将以 大肠杆菌(E．colO及其天冬氨酸酶(职：4·3·1·1)把富马酸转化为二一天冬氨酸为体系，讨论底物(尤 其是高浓度底物)对细胞形态和结幸句的影响，对酶璀化反应的影响，考察细胞的渗透性，并解释 一 它们之间的关系． 。 l材料与方法 ， 1．1酶细胞的培养 1；1303 1．1_l实验菌种正coliATCC 1．1．2培养基富马酸铵1．O％：富马酸钠0．5％；玉米浆3．4％；蛋白胨O．2％；KH2P040．05％； MgS04‘7H20O．05％，pH7．∞7．5- 置于摇床于37C培养20h，摇床转速190r／min。 1．2生物样品的制备 1．2．1主要试剂戊二醛固定液(2．5％，去离子水配制)：锇酸(OsO．)固定液(2％，去离子水配制)； 磷酸盐缓冲液(PBs)：pH7．2～7．4。 1．2．2主要仪器和设备SEM505扫描电镜：LKB-V超薄切片机；H600透射电镜。 1．2．3扫描电镜样品的制备见文献【6]。 l_3细胞渗透性测定 细胞渗透化程度可以通过在260Ⅲ处测定胞内物的吸光值来衡量17】。 1．4天冬氨酸酶活力的测定参见文献【8】。 2结果与讨论 2．1天冬氨酸酶细胞在不同底物浓度下的反应行为 游离大肠杆菌在不同的底物浓度下有着不同的酶催化反应历程(见图1)。较高底物浓度(16％) F的酶细胞在8h以前，催化速度很慢。而后催化反应速度加快。对富马酸盐的转化很彻底(转化 率为99．2％)：12％、10％的底物前期反应与16％的底物相同．以后的反应速度较慢：7．5％的底 物则自始至终维持很慢的反应速度，且对富马酸的转化很不彻底(转化率为63％)。由此可见，游 离整体细胞的催化反应具有如F现象：一是高浓度底物在酶 {… 的催化反应过程中具有较高的反应速度；二是高浓度底物具 i !… 有较高的转化率；三是催化反应在前期有个迟滞期。现象一 ! 二。” ： 释则需要对酶细胞的催化行为作进一步的观察。 ；。” 。 。。，：：。，犍．：臻．嚣，” 图1酶细胞催化反应行为 ◆)1肼(●)l器(△)IOIL(o)．7晶 一!■ A 10％底物中(8000倍) b 16％ff￡物中(8000倍) 一■ C 10％底物中(10000倍) d 20％底物中00000倍) 图2酶细胞在反应过程中的形态 2．2酶细胞在催化反应过程中的形态 从扫描电镜(图2，a、b)可以发现，酶细胞经底物环境下并没有发现如某些文献所说的“自 溶”现象，而是保持着较为完好的细胞形态。 c 在视野放大的扫描电镜(图2 d)和透射电镜(图3)下可发现高浓度底物F的酶细胞与低浓度 底物下的细胞有区别： (1)细胞表面发生了绉褶，有明显的凹陷(图2(d)中细胞中的黑点便是)： (2)切片观察细胞膜变薄、松驰、不明显