杂交瘤细胞生长和耗氧速率的关系及其应用.pdfVIP

杂交瘤细胞生长与耗氧速率的关系及应用 全志明李峰曹竹安‘ 孔建 (清华大学化工系 (卫生部北京生物制品研究所北京iooooo) 北京1Q0084) 摘要 杂交瘤细胞的限制性基质补井培养中鼍到的一个问题是如何方便．精细地控制关键 性底物的浓度．本文在一个IOL的生物反应嚣中，研究了杂交瘤细胞C50在无血清培养条件下生 长和能量代谢的特性．结果表明细胞能量代谢和生长密切相关．耗氧速率(OUR)晦够及时， 敏感地反映细胞代谢活力的改变，可以作为过程控制的主要参数． 关冀词杂交瘤无血清耗氧速率(OUR)补料培养 1概述 I ： 杂交瘤细胞的大规模培养技榔匠年来有了长是的发展．在代谢方面的研究表明杂交瘤细胞 的能量代谢是一个低效的系统，其主要的能源物质——葡萄糖和谷氮酰胺的消耗速率在一定范 围内随着底物浓度的增加而增加，同时积累有害的副产物——乳酸和铵离子，影响高细胞密度 的实现。通过限制性补料的方式，；控制葡萄糖和答氨酰胺的浓度在低水平上，可以大大提高其 利用效率，减少乳酸和铵离子的生成，从而延长培养周期．提高细胞密度【l—I。 在实际应用中遇到的一个重要问题是如何很好地控制补料的速率。过高或过低的补料速率 都会对培养过程产生不利影响。候靠离线的细胞计数和营养物浓度分析，或者经验性的计量关 系．在培养过程中不断修正补料策略，曾经取得了较好的效果【‘。】。但考虑到频繁取样离线分析 所带来的诸多不便．希望能够对细胞的生长代谢状况进行在线监测，使生产过程稳定、安全地 运行。在线监测的参数包括耗氧速率、氧化还原电位甚至浊度。在有血清培养中，通过耗氧速 率和／或氧化还原电位的值来控制葡萄糖或谷氨酰膻的补料已做了初步的尝试【6“l。 本文研究了杂交瘤细胞在无血清培养条件下，耗氧速率以及能量代谢在过程中的变化特点， 考察了其作为补料速率控制的重要参数的可能性。 2材料与方法 2．1细胞系、培养基及培养条件 本文所使用的是分泌IgG型抗CEA单克隆抗体的鼠．鼠杂交瘤细胞C50，由卫生部北京生 Antifoam Co．LTD) F68和30×106A(Sigma)·试验在一个10L机械揽拌发酵罐(L．E．MAUBISHI 中进行。选择处于对数生长期的细胞，离心弃上清。用新鲜的CCM培养基悬浮后接种，接种密 用0．5N 深层通气维持在40％±20％的空气饱和度。搅拌转速为60～80r／min。 通信联络人。 2．2离线分析方法 葡萄糖利用葡萄糖氧化酶法(试jf!】盒)分析，乳酸采用三氯化铁比色法，细胞计数采用Trypan Blue染色排除法。 2．3体积耗氧速率(OUR)的测定 测定OUR时，先把DO值增加到60％空气饱和度左右，保持表面通气，停止深层通气，开 始测定过程。当DO值降到30％左右时，恢复深层通气。OUR则通过下式计算： 等=KLa(cnc01)一。UR (1) OUR测定过程中表面通气速率达到O．5L／rain，这样即使在细胞耗氧量最大的情况下．所消耗的 氧也仅占进气的O．5％以下，可以认为进气、出气和反应器上方空间的氧气分率相同。C+按照Henry 定律确定：KLa在本体系中事先测定，考虑到它在过程中的变化．培养结束后重新测定，结果表 明培养过程中K。a近似不变。 2．4qm的估算 杂交瘤细胞生成的ATP主要来自NADH和FADH的氧化以及糖酵解途径。由于细胞内ATP 的浓度与其转化速率相比可以忽略不计，因此可近锻认为ATP生成速率等于其消耗速率，得到： 叮』”23(P／O)qo：+厨h (2) 其中，g。、qo．和g。分别为ATP比消耗速率、比耗氧速率和比乳酸生成速率。式中P／O(磷氧 比)取为2．5㈣。夕是来自葡萄糖的鞲酸与总乳酸之比，引A这一系数是因为只有经糖酵解途径生 成的乳酸才直接产生ImolATP／mol磊酸。芦的值并不容易估算。参考文献值取为0．95[103。