5种尿液BK病毒DNA提取方法效果比较.pdfVIP

山东医药2011年第 鲞 ! 5种尿液 BK病毒 DNA提取方法效果 比较 秦 雪 ，蔡豪斌 。李 山h。何 雨 ，陈智平 。汤湘柳 1广西医科大学第一附属医院，南宁530021；2桂林医学院；3桂林英美特生物技术研究所； 4广西医科大学公共卫生学院；5广西区妇幼保健院遗传 中心 摘要：目的 探讨尿液 BK病毒DNA的最佳提取方法。方法 分别采用高速离心沉淀法、SDS煮沸裂解法、 NaOH煮沸裂解法、PEG沉淀法和Tris饱和酚抽提法提取尿中BK病毒DNA进行PCR扩增 ，对不同方法BK病毒检 出率结果进行比较。结果 高速离心沉淀法、SDS煮沸裂解法、NaOH煮沸裂解法、PEG沉淀法和Tris饱和酚抽提 法 BK病毒检出率依次为78％ 31／40 、100％ 40／40 、83％ 33／40 、95％ 38／40 、lOO％ 40／40 。结论 在对 BK病毒DNA的提取操作中，SDS煮沸裂解法灵敏度和安全性较高。 关键词：BK病毒，脱氧核糖核酸；提取方法 中图分类号：R446．12 文献标志码：B 文章编号：1002-266X 2011 O7-OO78-O2 BK病毒 BKV 属多瘤病毒家族。BKV感染通 完全降温后，于4℃ 、12000r离心 10rain，取上清2 常发生于幼儿时期 中位年龄为 5—7岁 ，主要 作为PCR反应模板。~ NaOH煮沸裂解法：取尿 经口和呼吸道传播。人感染BKV后可仅表现为发 液 1nd加入EP管中，4℃、12000r离心 10min，弃 热或上呼吸道感染症状 ；成人血清阳性率为70％一 上清。此时管底沉淀中会残留少许尿液，向其中加 80％ J。BKV在血清阴性者体内进行初期复制以 入 20mM的NaOH10 I，置沸水浴中煮沸 10rain 后，可在泌尿系统及淋巴细胞建立非复制的潜伏感 后马上移至冰盒，待完全降温后，于4℃、12000r 染L3．4J，对免疫功能正常的宿主不致病，但可引起移 离心 10rain，取上清2 作为 PCR反应模板。④ 植肾BKV肾病 BI：VAN 及造血干细胞移植后 PEC沉淀法：取尿液 1ml加入 EP管中，2500r离 迟发型出血性膀胱炎 。PCR法为尿液 BKV灵 心 10rain以除去细胞碎片，收集上清 5O ，加入 敏快速的检测方法，BKV—DNA提取量是影响检测效 20％PEC6OOO50 和2mol／L的NaC125 ，置冰 果的主要因素。2008年7月 ～2010年2月，我们分 浴中6h，12000r离心30rain，吸去上清，将沉淀悬 别采用5种方法提取尿液中的BKV—DNA，旨在探讨 浮于蒸馏水中，该悬液可直接用于 PCR扩增。⑤ BKV—DNA的最佳提取方法。 s饱和酚抽提法：取尿液 1ml加入EP管中，4℃、 1 材料与方法 12000r离心 10rain弃上清，轻轻控干，向沉淀中加 1．1 标本来源 于广西桂林地区随机抽取 以下人 入的PBS300 l及 SDS30 ，室温放置 1h，加入 群的晨尿标本 ：孕妇 、新生儿、肾内科住院患者、肾移 330 l嘶s饱和酚 ，轻轻颠倒混匀数次，4℃、12000 植术后患者、健康体检者等。采用 SDS煮沸裂解法 r离心 10rain，轻轻吸取上层液体 250 ，加入饱和 筛选出BKV阳性的尿标本4O份，每例标本尿液量 NaC1溶液22 I及 2．5倍体积的冷乙醇，轻轻混匀， 均 5ml。 4℃、12000r离心 10rain，弃上清，加入 70％ 冷乙 1．2 尿液BKV—DNA提取 ①高速离心沉淀法：取 醇 1ml，4℃、8000r离心 10rain，弃上清，轻轻控 尿液 1ml于EP管中，4℃、12000r离心 10rain，弃 干，晾干20rain，向管底加入双蒸水2O 1，混匀，制 上清，取残留在管底的少许液体2Ixl作为PCR反应 成DNA溶液待用。DNA提取后采用 PCR法扩增： 的模板。~sDs煮沸裂解法：取尿液 1rrd加人 EP 5O I反应体系，其 中5 l10×buffer KCI500 管中，4℃、12000r离心 10rain，弃上清。此时管底 mmo]／L，pH为8．8的riffs—HCI100mmol／L，MgC12 沉淀中会残留少许尿液，向其 中加入 20txl0．3％ 15mmol／L，Gelatin0．1％，Triton—XIO01％ ，1 l SDS，置沸水浴中煮沸 10rain后，马上移至冰盒，待 10mmol／L4xdNTPs，引物 Pa、Pb各 1 ，2．5utaq 酶。引物序列：上游及下游引物为针对BKVT抗原 基金项 目：广西医药产业人才小高地计划基金资助课题 广医人高 200801-03 。