手把手教会WB与免疫组化.pdfVIP

wwwwww..rriiggoorrbbiioo..ccoomm WB WB、免疫组化方法及配方 WWBB Westernblot Westernblot 一、免疫印迹法（WWeesstteerrnnbblloott） 原理： 免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗 体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测 定技术基础上发展起来的一种免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS的高分辨 力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印 迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可 以同时比较多个样品中同种蛋白的表达量差异。 其原理为，将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离，然后取固定化 基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下，使凝胶中的 单一抗原组份转移到印迹纸上，并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素 探针或免疫酶探针等，对抗原固定化基质膜进行检测和分析。 方法： 1、蛋白样品的制备：将待检组织（大块组织需剪切成小块）或细胞等样品用裂解液（常用 RIPA裂解液+蛋白酶抑制剂）裂解，一般的样品经裂解液处理数分钟后细胞均可破裂， 有些样品较难裂解，可用匀浆器辅助裂解，所得裂解液以10000～12000 g的离心力离心， 取上清即为实验样品（制备过程均需在4℃条件下进行，样品通常于-20℃保存，若使用 周期较长则保存于-80℃）； 2、测蛋白浓度：将所得样品用BCA 法或Bradford 法测浓度 BCA 法： A.. 根据有待测定的样品数量，计算好所需BCA 工作液的量，然后将BCA 试剂盒中的.. 试剂A与试剂B 按50：1的比例充分混合均匀，配制成所需量的BCA 工作液（需现配现用）； 将蛋白标准品用PBS 溶液稀释至终浓度为0.5 mg/ml； B.. 将稀释所得标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl（所加量的梯度可根据自己实验样品所.. 需浓度进行调节）加到96 孔板的标准品孔中，然后用PBS 将每孔中溶液补充至20 μl； 每个样品取1μl（当样品浓度较稀时，可视情况增加上样量）到96 孔板的样品孔中，用PBS 补足到20 μl； C.. 向加有标准品和样品的各孔加入200 μl BCA 工作液/孔, 于37 ℃放置30 分钟，使.. wwwwww..rriiggoorrbbiioo..ccoomm BCA工作液充分反应； D.. 测定波长为570nm 时各孔的吸光值，依据标准品的吸光值得到标准曲线，再根据所.. 得标准曲线计算出各个样品的蛋白浓度。 SDS SDS 3、配置SSDDSS--PPAAGGEE：按如下表做适量分离胶，倒至模具中，在胶上喷以70%乙醇将胶面压 平，等待分离胶凝固后将乙醇倒出并用吸纸吸去剩余的乙醇溶液； 聚丙烯酰胺分离胶 溶液成分 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml 6% SDS 6% SD