应用慢病毒载体介导RNA干扰(RNAi)技术动态研究不同发育期雌鼠下丘脑NELL2和GnRH基因及性发育的关系.pdfVIP

2011年第ll届中华医学会儿科学分会内分泌遗传代谢学组学术会议 资料汇编 结果 (1)对于经酶学诊断的15例糖原累积症II型患者，成功随访11例， 随访率73．5％。(2)其中3例为早发型，在生后数月一婴儿期发病，均有肌酶升 高和心脏受累，伴或不伴呼吸受累。家族史阴性，CK平均值906U／L(18．．198 U／L)。其中1例同时得到肌活检病理和基因检测支持。3例均在3岁之内死亡， 死因主要是肺部感染导致的呼吸衰竭。(3)其余12例为晚发型，发病年龄从2～ 22岁不等，均有肌酶升高，CK平均值1225U／L，3例家族史阳性。其中8例以肌 肉无力起病，2例表现为呼吸肌受累，1例表现为脊柱侧弯，1例表现为肌酶高 伴肝功异常。在12例中，仅有l例合并心脏受累。成功随访的8例患者中，4 例患者于发病3～5年死亡，均死于呼吸衰竭，存活的4例患者，其中3例自觉 肌肉无力症状加重，1例无变化仍需使用呼吸机。(4)全部15例患者均经过酶学 确诊，其中12例同时得到肌活检病理支持。其中有3例因呼吸功能受损严重应 用机械通气及呼吸机辅助治疗，辅以抗感染治疗。其余未进行相关治疗。成功随 访的11例患者中，7例患者死亡，均死于呼吸衰竭，死亡率63．6％。 结论 (1)15例糖原累积症II型／Pompe病患儿在临床表现上存在差异 性：全部患者都存在肌酶升高。早发型的患者都合并心脏受累，晚发型患 者中2／3者以肌肉无力为突出表现，可合并呼吸肌受累，心脏改变不明显。 (2)糖原累积症II型／Pompe病目前无有效的治疗方式，应用的治疗往往 以对症治疗为主。(3)糖原累积症II型／Pompe病患儿的预后与病程长短， 有无呼吸肌受累相关。 166．应用慢病毒载体介导RNA干扰(RNAi)技术动态 研究不同发育期雌鼠下丘脑NELL2与 GnRH基因及性发育的关系 上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院(200040) 周莎莎李嫔 目的通过慢病毒载体介导RNA干扰(RNAi)技术抑制幼年雌鼠下丘脑NELL2 资料汇编 2011年第11届中华医学会儿科学分会内分泌遗传代谢学组学术会议 基因表达，动态的研究不同性发育阶段雌鼠NELL2mRNA、蛋白表达变化，以及 其对GnRHmRNA表达和阴门开启时间的影响。初步探讨NELL2调控GnRH神经元 进而参与性发育启动的可能机制。 方法针对大鼠NELL2基因，构建NELL2真核表达载体和4对microRNA干扰质 mRNA 粒，分别共转染HEK293细胞，实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检；!贝IJNELL2 的表达情况，筛选出其中1对干扰效率最高的microRNA，通过重组方法构建慢病 毒干扰载体并包装成慢病毒。对幼年期(21日龄)SD雌鼠侧脑室分别注射生理盐 干扰病毒载体(干扰病毒组，V-miR，30只)，注射后各处理组再随机平均分为3 组(每组10只)，分别于30日龄、35日龄及45日龄时处死。观察并记录大鼠阴门 mRNA 开启时间。提取下丘脑组织，采用Real-timePCR方法检测下丘脑NELL2、GnRH 的表达，Westernblot检测NELL2蛋白表达。 结果 病毒干扰载体并包装成慢病毒，病毒滴度为1×109IJT／ml。(2)与对照组(盐水 对照或病毒对照组)相比，30日龄、35日龄及45日龄干扰病毒组NELL2基因和 蛋白表达水平均明显下降(P0．Ol或PO．05)。说明本研究构建的慢病毒干扰载 体在体内能够持续、高效的抑制NELL2基因的表达。(3)30日龄、35日龄干扰 病毒组GnRH基因mRNA表达显著下降(与同时间点对照组比较分别为PO．Ol和 响青春启动前期及发育早期GnRHmRNA的表达水平。(4)实验过程中观察各组雌 鼠阴门开启时间，结果干扰病毒组阴门开启时间与对照组相比明显延迟 (PO．01)。说明NELL2可以影响大鼠性发育启动。具体数据见附表1-4。 结论 (1)慢病毒介导RNAi技术在体内能够有效抑制NELL2基因的表达，进 一步抑制GnRH基因表达，此方