携带猪流行性腹泻病毒S基因的减毒沙门氏菌的构建和鉴定.pdfVIP

携带猪流行性腹泻病毒S基因的减毒沙门氏菌 的构建与鉴定 梁恩涛1 廖晓丹1 文心田1’2’ 黄小波1’2 曹三杰1’2 阳酉萍1 段素芬1 张 丹1 张小会1 (1．四川农业大学动物医学院，动物传染病与基因芯片实验室，四川雅安625014； 2．四川农业大学人兽共患病研究室与猪病防治研究中心，四川成都611130) 摘要 为构建可有效抵抗流行性腹泻病毒(PEDV)入侵的可诱导黏膜免疫反应的核酸疫苗，本研究 以RT—PCR扩增PEDVSC．L株的S基因主要抗原编码区域(简称S1，长2367bp，编码S蛋白N末端1．789 (pVAxD．S1)，对该重组菌株的生长曲线、携带质粒的稳定性、口服小鼠的安全性及目的基因在体内转录等 cFu／只口服免疫小鼠具有良好的安全性，携带的s1基因能在小鼠组织(回肠末端)内正常转录及表达。本 免疫DNA疫苗奠定了基础。 关键词猪流行性腹泻病毒；s基因；减毒沙门氏茵；构建；鉴定 dia曲eavi— dia丌hea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemic 猪流行性腹泻(porcineepidemic 要特征的一种高度接触性肠道传染病。该病是引起仔猪死亡的主要病原之一。自2010年秋冬以来，在我国 及其他亚洲国家的不同地区，均出现了PED的重新爆发性流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。 白、次要嵌膜蛋白sM蛋白、主要嵌膜蛋白M蛋白、核衣壳蛋白N蛋白四种结构蛋白。其中，S蛋白位于病毒 粒子表面，在决定细胞亲嗜性、致病性等关键作用，同时，s蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，具备良 好的免疫原性且是能诱导产生保护性中和抗体的结构蛋白，因此s基因是PEDV基因工程疫苗的主要抗原 靶基因。 鉴于PEDVs蛋白良好的免疫原性并诱导产生保护性中和抗体，本研究将主要编码S蛋白N端抗原相 (pVAxD—s1)，并对该菌株的生物学特性进行鉴定，为后续开展该菌株的口服免疫评价和应用奠定了基础。 作者简介：梁恩涛(1989一)，男(汉)，河南平顶山人，硕士；廖晓丹(1983一)，男(汉)，四川成都人，博士。 四川省畜牧兽医学会2014年学术年会 1 材料与方法 1．1 毒株、菌株、细胞和动物 猪流行性腹泻病毒sC．L株，由四川农业大学动物传染病实验室分离保存；大肠杆菌DH5仅、减毒沙门氏 龄(雌性，清洁级)购自成都生物制品研究所。 1．2 主要试剂 DNA 录试剂盒、E×细、pMDl9一TsimpleVector、T4 PCR RNA抽提试剂盒、2×死q Kit PlasmidMini 北京天根生物工程有限公司产品；去内毒素质粒提取试剂盒Endo．Free I购自美国0MEGA 2000购自美国Invi￡rogen公司。 公司；脂质体Lipofectamine 1．3 引物 参照GenB柚k公布的PEDV(cV777株)cDNA序列，利用Oligo6．o软件没计两对引物。序列如下：上 游引物Pl：5’一GGAATTCAccATGAGGTCJITrA I内切酶位 7一CGCCGCCGCTCATCTAATACTCATACTAAAGTTGGTGGGAA-3 点)，下游引物：5 7(下划线处为舳￡I内切酶 成。 1．4 PEDV Sl基因的克隆与测序 收获Vem细胞培养的PEDV 后，以抽提RNA为模板，依照反转录试剂盒说明，反转录成cDNA，反转录条件为37℃反应15min，85℃反 应5s。取反转录cDNA 1灿，使用TAKARAE×死口进行PCR扩增，反应条件为9