研究报告：犬细小病毒胶体金快速诊断试纸的研制与应用;.pdfVIP

研 究论文 犬细小病毒胶体金快速诊断试纸的研制与应用 田克恭 王宏伟 陈西钊 金萍 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司 犬细小病毒是细小病毒科、细小病毒属、猫细小病毒的一个变异种 ，可引起犬出血性肠炎和心肌炎。该 病发病急.传染性强，死亡率高，对实验犬、军、普犬等集中饲养的犬群以及宠物犬均具有很大的危险性。故 对感染犬及时做出诊断，采取有效措施进行治疗，防止疫情蔓延甚为重要。 犬感染CPV后，主要通过粪便向外排毒，急性期病犬的呕吐物和唾液中也含有大盆病毒。其中感染后 4一，天，每克粪便中的病毒滴度可达109TCLD50,因此粪便即是犬间传递感染的主要传染源，也是诊断本 病的主要病料们〔。 从粪便中检测CPV的方法很多，最常见的是血凝(HA)实验和酶联免疫吸附实验(ELISA)。这些方法 多存在操作繁琐，费时较长等缺点次为了解决CPV的快速诊断间题，我们在成功地建立了分泌抗CPV单克 隆抗体(McAbs)杂交瘤细胞株的基础上，用纯化的CPVMcAb，和CPV多克隆抗体，在国内首次研制成功胶 体金快速诊撇纸。本实验的“的”其与国夕同卜类产品进行比州，现报告如下。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1绿金酸(AuCI.HCL3.4H20):北京化学试剂厂出品。 1.1.2抗犬细小病毒单克隆抗体:为本公司制备。 1.1.3犬细小病毒(CPV):取自用醉联快速诊断试剂盒测定为阳性的病犬粪便。 1.1.4CN膜:美国MILLPORE公司的产品。 1..15羊抗鼠IgG:本实验是生产。 1.1.6玻璐纤维:南京玻瑞纤维设计研究院产品。 1.1.7美国IDEXXLaboratories公司研制的CPVELISA试剂盒，5头份/包装，共8个包装,40头份。 1..18送检粪便:共计87份，其中80份采自临床疑似犬细小病毒感染病例，，份采自临床健康犬。 1.1.91%株红细胞悬液(100m1) 0.015mol/dm3PH7.2PBS100ml BSA 100mg 混合后，加洗涤好的新鲜猪红细胞2ml，轻轻摇匀后，置4℃保存备用。 1.2方法 1.2.1CPV单抗及多抗的纯化:用辛酸结合硫酸钱的方法纯化犬细小病毒单克隆抗体。。 1.2.2胶体金:按121Frens报道的方法制备，其胶体金预粒的直径为IS-20nma 1.2.3用纯化好的CPV单抗联接胶体金悬浮于O.Olmol/L的PBS中(内含1%的BSA,1.5%的PEG), 测定OD值为40D,然后用吸管小心的将胶体金分散在事先准备好的玻璃纤维上，冰冻干澡后备用。 1.2.4CN膜的处理:分别将纯化好的羊抗鼠IgG(5mg/ml)以及CPV单抗(2mg/ml)用免疫喷膜机喷涂 在CN膜形成两条线，一条为阳性线，一条为阴性线，干燥后备用。 1.2.5试纸的装配:取一块尺寸为80mmx200mm厚度为0.45mm的硬塑料板，分别将玻璃纤维(25mm x200mm)，冻千胶体金玻璃纤维(3mmx200mm),CN膜(已喷有两条抗体线25。二x200mm)，吸水滤纸 (25mmx200mm)装配，并用双面胶带枯贴其上。然后用切割机切成4mm宽的试纸外加塑料包装盒即可。 ⑧ 2003学术年会 1.2.6胶体金试纸操作步骤 a.取病犬粪便1克，加生理盐水5毫升，充分摇匀后静置5分钟; b.取粪便上清夜5一7滴，滴于试纸样品孔(:)中，水平放里,30分钟内观察结果。 。.结果判定 阳性:检测区(T)和对照区(C)分别出现分别出现一条紫红色的线; 阴性:只在对照区(C)出现一条紫红色线; 无效:无紫红色线出现。 1.2.7美国ELISA试剂盒操作步骤 :.用棉棒挑取少许粪便tI于SAMPLE孔中，在孔中将粪便混匀，静里1一2min; b.将带有预过滤膜的反应棒(Probe)插人SAMPLE孔中，用力向下压，使Click，进人孔内静置1- 2min; 。.取出反应棒(Probe)，此时预过滤膜留在SAMPLE孔中;用力压下Purle钮;将反应棒按顺序擂人下 列孔中: #2号孔(酶结合