nanoLC—ESI／MS／MS在ECV304细胞蛋白质组学研究中的应用.pdfVIP

中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2009，25(1)：205—208 · 205 · [文章编号] 1000—4718(2009)01—0205—04 · 实验技术 · nanoLC —ESI／M S／M S在 ECV304细胞蛋 白质 组学研究中的应用 李菊玲 ， 曾耀英 ， 季煜华弘，杜 彬 (复旦大学上海医学院病理学系，上海200032；南通大学医学院病理学教研室，江苏 南通 226001； 暨南大学 。组织移植与免疫中心，医学院，广东 广州510632) [摘 要] 目的：应用纳升液联用技术 (nanoIC—ESI／MS／MS)对 ECV340 细胞蛋白质组学进行初步分析。 方法：提取 ECV304细胞总蛋白，经变性、还原 、烷基化和酶解，nanoLC—ESI／MS／MS对酶解后的肽段进行分析，数 据库 (Swissprot)检索鉴定蛋白质 ，生物信息学工具对所鉴定的蛋白质进行细胞定位和功能分类。结果：从8Ixg细 胞总蛋白中鉴定了120种蛋白质 ，所鉴定蛋白质的分子质量 (MW)范围从6648D至280739D，MW20kD的蛋 白质 占24．2％，MW 100kD的蛋 白质 占5．O％；主要位于细胞质、细胞骨架、细胞核和细胞膜，分别为27．8％、 19．0％、15．2％和 10．1％；大多为结构蛋白质和催化活性的蛋白质，分别为36．4％和34．1％，具有信号转导活性的 占11．4％；其中角蛋 白8、18和vimentin等为内皮细胞特异表达的蛋 白质。结论：本研究建立了nanoLC—ESI／MS／ MS分析ECV304细胞的蛋白质组学方法 ，为内皮细胞及内皮细胞损伤机制的蛋白质组学研究奠定了实验基础。 [关键词] nanoLC—ESI／MS／MS技术；ECV340 细胞；蛋白质组 [KEYWORDS] nanoLC—ESI／MS／MStechnology；ECV340 cells；Proteome [中图分类号] R34 [文献标识码] A 血管内皮是衬于所有血管腔内表面的单层扁平上皮，除 Tris—HC1(pH8．0)]，Brandford法测定蛋白浓度，分装、一8O 具有屏障功能外它还是一个十分活跃的多功能 内分泌器官， ℃保存。在 100wg的蛋白样品中加入终浓度为 10mmol／L 合成及分泌多种生物活性物质，参与多种生理和病理过程。 DTI37oC1h还原，终浓度为25mmoL／L碘乙酰胺室温避光 血管内皮的损伤是诱发多种心脑血管疾病的共同病理生理 30min进行烷基化修饰，最后用 100mmol／LTris—HC1(pH 基础，对其机制的认识将有助于相关疾病的预防和治疗 J。 8．0)稀释上述样品使尿素浓度低于2mol／L，加入质量比为 基于质谱技术和生物信息学的蛋白组学是后基因组时代兴 1：50的测序级胰蛋白酶 ，37℃孵育 16h。 起的新型学科 ，是从整体水平对蛋白质的综合分析，在 了解 酶解的蛋 白样品加入终浓度为 0．1％的甲酸后进行 疾病发生的机制、寻找疾病相关的 “生物标记物 (biomarkers) NanoLC—ESI／MS／MS分析。Agilent1100NanoflowHPLC— 等诸多领域中发挥重要的作用 。ECV340 细胞是人脐静脉 ESI系统以trap模式运行 ，分析柱为C18Vaydac218MS (150 内皮 自发转化形成的细胞系，被作为血管内皮细胞 的模型广 Ixm×150mm，Grace)，捕获柱为 C18PepMapTM(300 m×5 泛应用 J，本研 究拟采用 nanoLC—ESI／MS／MS技术对 mm，LC—ESIPackings)，流动相包括溶液 A(0．1％甲酸，5％ ECV340 细胞的蛋白质组学进行初步分析，为内皮损伤机制 ACN，95％H2O)、B溶液 (0．1％甲酸，5％H2O，95％CAN)，进 的蛋白质组学研究奠定实验基础。 样体积8 ，连续梯度洗脱 ，流速