Tim-3在慢性HBV感染介导的CD8~+T细胞耗竭中的作用和其负调控机制的研究--《山东大学》2012年博士论文.docVIP

Tim-3在慢性HBV感染介导的CD8~+T细胞耗竭中的作用及其负调控机制的研究--《山东大学》2012年博士论文 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)基因组长3.2kb,为部分双链环状DNA。成人感染乙型肝炎病毒后约有5%发展成慢性感染,而慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是肝硬化和肝癌的主要原因。乙肝病毒感染的过程中,病毒本身并不会直接引起肝细胞的损伤,宿主的抗病毒免疫应答导致的肝细胞损伤是各种肝脏疾病发生的重要机制。有文献报道,CD8+T细胞通过直接对HBV感染肝细胞的杀伤作用及分泌抗病毒细胞因子两种机制来清除病毒。在慢性HBV感染过程中,病毒特异性CD8+T细胞耗竭及其免疫功能失调(弱应答或者不应答)是病毒持续存在的重要原因,但是其分子机制尚不清楚。 T细胞免疫球蛋白粘蛋白(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein, Tim)基因家族是2001年发现的新型免疫调节基因家族。人类Tim家族定位于5q33.2,该家族包括3个成员Tim-1,Tim-3和Tim-4。人Tim-3分子最初是作为Thl细胞的特异性表面标记被克隆的,其编码蛋白由胞外段(含181个氨基酸)、跨膜区(含21个氨基酸)和胞内区(含78个氨基酸)组成。大量研究表明,Tim-3分子在多种免疫细胞如自然杀伤细胞(natural killer cell, NK cell),树突状细胞(Dentritic cell, DC),CD8+T细胞,Th17细胞,单核/巨噬细胞(monocyte/macrophage)表面均有表达。Tim-3与其配体galectin-9结合介导Thl细胞凋亡及免疫耐受的形成,从而负向调节Thl型免疫应答,在多种自身免疫性疾病如NOD (non-obese diabetic), EAE(experimental autoimmune encephalomyelitis)小鼠模型中发挥重要作用。近期有研究报道,Tim-3通过抑制CD8+T细胞的应答参与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)及丙型肝炎病毒(Hepatitis C viurs, HCV)感染。本课题组前期研究证实Tim-3通过抑制NK细胞功能参与慢乙肝的发生。但在慢乙肝的发病过程中,Tim-3是否影响CD8+T细胞的功能尚未见报道。 本课题利用临床标本及体外细胞实验研究Tim-3在慢乙肝患者外周血CD8+T细胞表面的表达及其与临床指标相关性,进而通过体外共培养及功能阻断实验研究Tim-3在慢乙肝患者CD8+T细胞功能失调中的作用及其机制,为慢乙肝发病机制的研究及疾病的治疗提供新的实验依据。 第一部分慢乙肝病人外周血CD8+T细胞Tim-3表达显著升高,并介导病毒特异性CD8+T细胞耗竭 Tim-3表达于多种免疫细胞并通过多种途径调节固有免疫及适应性免疫应答。CD8+T细胞是机体抗病毒的主要免疫效应细胞,其数量和质量在慢乙肝的转归中起着非常重要的作用。已有研究表明,Tim-3通过抑制CD8+T细胞功能参与HIV及HCV慢性感染,但Tim-3是否调节慢乙肝病人CD8+T细胞功能并介导CD8+T细胞耗竭,迄今尚未见报道。本研究首先检测了慢乙肝病人及正常人外周血CD8+T细胞表面Tim-3的表达。 1.慢乙肝病人外周血CD8+T细胞Tim-3表达明显升高,且Tim-3表达与HBV感染相关 收集56例慢乙肝患者,34例健康志愿者作为对照。流式细胞术检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中CD8+T细胞Tim-3的表达。结果显示：慢乙肝患者外周血CD8+T细胞中Tim-3阳性细胞的百分比(p=0.0008)及平均荧光强度(MFI)(p=0.0005)均明显高于健康志愿者,且HBeAg阳性的慢乙肝患者外周血CD8+T细胞表面Tim-3表达明显高于HBeAg阴性患者(p=0.0074)。进一步统计学分析发现,CD8+T细胞表面Tim-3的表达水平与患者血清HBV-DNA滴度呈正相关(r=0.3139,p=0.0298)。 2.与Tim-3阴性群相比,慢乙肝患者外周血Tim-3阳性CD8+T细胞表现为活化但功能抑制的表型 本研究收集28例慢乙肝病人及12例健康志愿者外周血,流式检测CD3+CD8+T细胞CD28及Tim-3表达,结果显示：与健康对照组相比,CHB患者CD8+T细胞中Tim-3的表达上调主要表现在CD8+CD28+T细胞群(p=0.0233)而不是CD8+CD28-Ts群(p=0.2072)。为了进一步研究Tim-3表达对CD8+T细胞的