成年大鼠胰岛细胞的体外培养.pdfVIP

维普资讯 虫国病理生理袈 ChineseJournalofPathophysiology 2007，23(12)：2491—2493 · 249l · [文章编号] 1000—4718(2007)12—2491—03 · 实验技术 · 成年大鼠胰岛细胞的体外培养 徐 霞 ， 卢 瑾， 刘关莲， 谢 平， 谷亚鹏， 宋惠萍 (中南大学生物科学与技术学院生物化学系，湖南 长沙 410078) [摘 要] 目的：建立一种高效、实用的成年大鼠胰岛细胞分离、纯化和体外培养的方法。方法：采用胰管内 逆行灌注胶原酶溶液消化 ，密度梯度离心纯化胰岛，显微镜下手挑法捡出全部胰岛。分离后胰岛置胶原中培养，利 用RT—PCR检测胰岛细胞特异基因的表达。结果：分离的胰岛细胞呈圆形或椭圆形，双硫腙染色呈猩红色 ，在胶 原中培养能保持形态完整，表达胰岛细胞特异性基因PDX一1和 insulin。结论：本胰岛分离技术已趋于完善，获得 的胰岛纯度高，培养效果好。 [关键词] 胰岛；细胞培养；大鼠 [KEYWORDS] IsletsofLangerhans；Cellculture；Rats [中图分类号] R363 [文献标识码] A 糖尿病是人类的 “第3号杀手”。1型和部分2型糖尿病 lmin。消化物经过0．5mm尼龙滤网过滤，再用 Hanks液洗 患者需注射胰岛素维持血糖恒定 ，长期注射给这些患者造成 2次。 极大的痛苦。胰岛移植为这些糖尿病患者带来 了希望。研 2．2 胰岛细胞的纯化 以histopaque密度梯度离心来纯化 究证实胰岛移植能稳定地控制葡萄糖浓度，有效防止糖尿病 胰岛。将消化物沉淀用8mLhistopaque(1、077g／mL)悬浮， 并发症的发生和发展，明显提高病人生活质量…。 目前胰岛 在其上缓慢加入 8mLDMEM／F12培养液，800×g离心20 移植领域的研究取得显著进步，但是胰岛供应不足是阻碍胰 rain，DMEM／F12与histopaque1．077g／mL之间主要为胰岛细 岛移植广泛应用的重要原因之一 。如何获得大量的胰岛 胞，底部沉淀主要为腺泡细胞和导管细胞。吸取2层之间的 成为研究的热点 。本实验 旨在应用 1种改良的方法分离 细胞，用Hanks液洗2遍，DMEM／F12(Hyelone)重悬细胞 ，以 出高数量和高质量的胰岛，为胰岛移植的开展奠定必要的技 上过程均在冰上操作。通过histopaque密度梯度离心后的胰 术和理论基础。 岛细胞一般只能达 70％左右的纯度，为了达到 100％的纯度， 须在解剖显微镜下手挑单个胰岛。镜下观察胰岛为卵圆形、 材 料 和 方 法 边缘光滑、被DTZ染色成猩红色的细胞团。绝大多数胰岛的 1 材料 大小范围在200—300LLm之间。镜下用毛细吸管将大小为 1．1 实验动物 SD大鼠，雄性，体重230—250g，清洁级，由 200—300 m之间的胰岛吸至另一个装有培养基的培养皿 中南大学实验动物学部提供。 中，同时计算胰岛数。 1．2 试剂 DMEM／F12培养基 (Hyelone)；胎牛血清 (杭州 2．3 胰岛细胞纯度和活度的测定 DTZ染色鉴定胰岛细胞 四季青公 司)；IV型胶 原酶 (Invitrogen)；Hepes、histopaque 的纯度，双硫腙 (dithizone，DTZ)是一种金属检测试剂，可以与 1．077(Sigma)。 胰岛素颗粒中所含的锌离子特异性鳌和，从而将胰岛细胞染 1．3 仪器 超净工作台(北京)；倒置相差显微镜 (重庆光学 成猩红色，而其它细胞不被染色。纯化后的胰岛细胞中分别 仪器厂)；解剖显微镜 (南京江南光学仪器厂)；CO 细胞培养