U6与H1双启动子载体用于RNAi的实验研究.pdfVIP

维普资讯 中 国 生 物 工 程 杂 志 第 24卷第 11期 CHINAB10TECHN0L0GY 2004年 11月 U6和 H1双启动子载体用于RNAi的实验研究 蹇 锐 程小星一 彭 涛 邓少丽 蒋 静 (重庆市第三军医大学微生物学教研室 重庆 400038) 摘要 为建立一条简便、有效的构建哺乳动物细胞随机RNAi文库技术路线，首先通过 PCR将 19 ～ 21ntsiRNA编码序列及终止信号等元件引入 U6启动子下游，再将该扩增产物定向克隆至H1 启动子的下游。构建的双启动子载体中，U6和 H1相对排列，均以其间插入的靶序列为模板，分 别转录出其正义和反义链，形成功能性 siRNA。以EGFP和bcl一2为靶基因的实验表明，该方法构 建的载体可有效地干扰相应基因的表达。 关键词 RNAi 双启动子载体 EGFP bcl一2 RNA干扰(RNAi)可 以高度特异和有效地抑制 能转录出短发夹结构 RNA(shRNA)的 RNAi文 基因的表达 ，已成为功能基 因组学研究的重要技术 库 。虽然这一方法有可能建立可针对任何基因 之一 。。在线虫等模式生物的研究中，通过建立 的随机RNAi文库 ，但技术非常复杂，建库的难度相 随机的功能缺陷RNAi文库，再进行表型的筛选，已 当大。 在其胚胎发育等领域取得了重要的发现 J。该文 本文将 19～21nt的靶特异性序列合成至引物 库用含相对的双rI7启动子的载体，可从一个随机 的5末端，通过一次 PCR和亚克隆，构建能转录出 克隆的 cDNA模板分别转录出长 的正义和反义 功能性 siRNA的双启动子载体，用于干扰 EGFP和 RNA，形成双链 RNA(dsRNA)，在体 内被 Dicer切割 bcl一2基因的表达效果明显。此方法有助于快速建 成小片段的siRNA，特异地抑制靶基因的表达。由 立高效的RNAi表达载体，并有望用于大规模的基 于细胞外dsRNA不能在哺乳动物细胞有效地诱导 因功能筛选 。 RNAi，另外，长链 dsRNA(30nt)可导致哺乳动物 l 材料与方法 细胞的毒性反应 ，出现非特异的细胞生长停滞和凋 亡，上述体外转录长链 dsRNA建立RNAi文库的方 1．1 菌种、质粒及主要试剂 法不能应用于哺乳动物及其细胞。 E．coliDH5a及 pBlueScriptⅡ KS、pEGFP—N，、 在哺乳动物细胞 ，诱导 RNAi的主要方法是通 pSilencer1．0U6质粒为本室保存，pUCm—T载体、限 过体外化学合成或 Dicer酶切割产生的siRNA转染 制性内切酶及其他工具酶等购 自上海生工 (生物工 细胞，以及通过载体 或 siRNA表达 盒 (siRNA 程技术服务有限公司)，Taq酶及 Pyrobest高保真 expressioncassette)在细胞 内转录 siRNA。到 目前为 酶 均 购 自 日本 TaKaRa 公 司，转 染 试 剂 止 ，文献报道 的在哺乳动物细胞建立 RNAi文库 的 LipofectAMINE。。。购 自美 国 Invitrogen公 司，质粒及 的方案有两类 。最常用的一种方案是通过构建众 胶 回收提取试剂盒为上海博亚 (生物技术有限公 多的能针对 已知基因的 siRNA表达载体或 siRNA 司)产品，ECL试剂、小 鼠抗 Bcl一2多抗(N一19)为美 表达盒，形成有限的RNAi文库。该方法费用高、工 国SantaCruz公司产品，辣根过氧化物酶及 FITC标 作量大，而且文库的覆盖面有限 。另一个方案是 记的羊抗 鼠IgG购 自北京 中山(生物技术有限公 通过将 cDNA切割成