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第十章　动物细胞融合 第一节 细胞融合的基础知识 植物细胞融合与人造小鼠培育过程 单克隆抗体技术（杂交瘤技术） 单克隆抗体：一种浆细胞只产生一种类型的免疫球蛋白分子。从一个单克隆细胞产生的抗体分子，即称为单克隆抗体，其具有独特的均一结构。 单克隆抗体技术 单克隆抗体制备流程： 用特异抗原免疫实验动物 取含大量B细胞的脾细胞 鼠骨髓瘤细胞 细胞融合 筛选杂交瘤细胞 生产单克隆抗体 杂交瘤技术过程 骨髓瘤细胞的获得与培养 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高。 一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。 筛选原理 DNA的合成： 正常途径：糖、氨基酸——核苷酸——DNA ，可以被氨基蝶呤阻断。 胸腺嘧啶核苷激酶（TK） 补救途径：核苷酸前体 ——核苷酸——DNA 　　次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT） 氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成DNA，因此HAT培养基上的细胞不能采用该途径合成DNA。 融合所用的瘤细胞一般是HPRT－与TK－缺陷型，因此也不能采用补救途径合成DNA。 两条途径被阻断后，有怎样的结果呢？ 瘤细胞（未融合的和多聚体）命运：因不能正常合成DNA而死亡。 融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞内的HPRT与TK ，因此可利用培养基中的嘌呤与嘧啶采用补救途径合成DNA，因此可在HAT培养基中存活与繁殖。 第三节单克隆抗体的大量生产 1）实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107cells／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml。待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg／ml。 采血量有限。 2）腹水制备法 腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。 腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml， 这是目前最常用的方法。 3）单克隆抗体的大规模生产　　　　　　-生物反应器 生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗 杂交瘤细胞：WuT3杂交瘤细胞 生物反应器 ：采用3.5升、14升、75升搅拌式生物反应器，具有自动消毒、控制温度、转速、DO和pH等功能。 培养液 ：RPMI1640中添加庆大霉素至100单位、胎牛血清（NcS）或健康人血清（HuS）、添加剂HEN（蛋白胨和糖类）。 培养方式 控制温度在37℃、pH7.1、转速40-60r/min、DO在30-50%，分批和半连续培养。 离心机除去细胞，收集上清液用于单抗浓度、免疫活性、热原等分析测定。 抗体工程 动物抗原的不足：例如——虽然可以识别抗原却不能激活补体系统，常被人免疫系统识别产生人抗鼠抗体或激发免疫反应，易被清除等。 抗体修饰与人源化抗体：例如将人抗体恒定区与鼠可变区拼接。 单克隆抗体的应用 小　结 细胞融合的定义、原理与方法 融合细胞的筛选方法：杂交瘤细胞的筛选方法 单克隆抗体的制备方法 3.5升搅拌式生物反应器分批培养，WuT3杂交瘤细胞经48小时适应期后进入对数生长期，维持24小时后进入平衡期，这一阶段持续约48小时，分泌单抗。 继续放大至75升生物反应器，半连续生产，细胞浓度达到1.5×106/ml，单抗产量为50-70μg/ml。这样每间隔2天收获1批，获得上清液40升，平均日产单抗达1克。 提高免疫分析或其他新分析的灵敏度和重复性 组织相容性抗原、互补成分、血液凝固、血型抗原、干扰素、雌激素、 精子抗原、黄体酮、人生长激素、血细胞介素、促胃液素 诊断 性传播疾病、血型、怀孕或排卵、癌（早期癌抗原的检测） 治疗 药过剂量的校正、减少由骨髓移植带来的危险、检测癌转移、治疗癌症 （直接地或定向细胞毒药物）、糖尿病。 T细胞杂交瘤 淋巴细胞活素T细胞生产：免疫干扰素、巨细胞激活因子、白细胞介素－1.2、 集落刺激因子（CSF）、B细胞分化因子（BCDF）。 * * 细胞融合机理 单克隆抗体的 大规模生产 单克隆抗体技术 细胞融合 的基础知识 细胞融合（cell fusion）：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。分为自发细胞融合和诱导细胞融合。