牦牛CAPN1基因的克隆和序列分析.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（１２）：９０～９４ 牦牛ＣＡＰＮ１基因的克隆与序列分析  费春红　吴建平　杨　联　张利平 　王　佳 （甘肃农业大学动物科学技术学院　兰州　７３００７０） 摘要　ＣＡＰＮ１是影响肌肉嫩度的数量性状位点 （ＱＴＬ）的候选基因。根据ＧｅｎＢａｎｋ发表的普通牛 ＣＡＰＮ１基因序列设计特异性引物，以天祝白牦牛ｃＤＮＡ为模板，分段进行ＰＣＲ扩增，克隆，测序。 应用生物软件ＢｉｏＥｄｉｔ对各测序结果进行序列拼接共获得牦牛ＣＡＰＮ１ｃＤＮＡ片段２２６７ｂｐ，其中包 含一个２１５１ｂｐ的完整的开放阅读框（ＯＲＦ），以及 ３′和 ５′末端非编码区的部分序列（７７ｂｐ和 １６６ｂｐ）。分析表明：牦牛ＣＡＰＮ１基因编码区全长２１５１ｂｐ，共编码７１６个氨基酸。与已报道的牛， 猪，人小鼠的序列进行比较，核苷酸同源性分别为９９．３％，９３．９％，９０．０％ ，８５．５％ 。预测氨基酸 的同源性分别为９９．４％，９６．１％，９４．６％，８９．０％，并且对牦牛ＣＡＰＮ１４个结构域分别进行 ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ发现４个结构域在以上４个物种中都显示出很好的保守性，最为保守的在结构域 （＞ Ⅳ ９６％）。牦牛与牛产生的 １４个核苷酸突变中，有３个产生了氨基酸突变，均发生在结构域 。构 Ⅲ 建分子系统进化树表明：聚类结果与传统分类学相符。 关键词　牦牛　钙激活蛋白酶　克隆　序列分析 中图分类号　Ｑ７８５ 　　Ｃａｌｐａｉｎ是一类特异性依钙激活的中性半胱氨酸内 关的标记辅助选择（ＭＡＳ）奠定基础。为攻破牦牛肉 肽酶，其广泛地分布于绝大多数动物细胞中。其中  （包括牛肉）嫩度低的技术难题在基因水平上提供理论 μ ｃａｌｐａｉｎ是由微摩尔钙激活的无组织特异性的钙蛋白 依据。 ［１］ ［２］ 酶。到目前为止，科学家已经成功地在人类 、鼠 、 １　材料与方法 ［３］ ［４］ 牛 、猪 、鸡和斑马鱼等物种上进行了 ｃａｌｐａｉｎ μ ｃＤＮＡｓ的克隆和测序，并且已经获得了这种ｃａｌｐａｉｎ蛋 １．１　材　料 白在组成和结构等方面的很多特性。 　　本试验材料为天祝白牦牛背最长肌组织，采自甘 肃华藏寺。克隆载体 ＰＧＥＭ Ｔ，Ｔ４ＤＮＡ连接酶及有 　　研究表明，ｃａｌｐａｉｎ对于肌原纤维的降解和肉在  μ ［５～７］ 关缓冲液（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）。ＤＨ５ 菌株为甘肃农业大 冷冻贮藏过程中的嫩化具有重要作用 ，其大亚基 α 的编码基因ＣＡＰＮ１可作为影响肌肉嫩度的数量性状位 学重点实验室提供。ＰＣＲ产物纯化回收试剂盒，ＰＣＲ ［５］ 扩增用试剂（北京鼎国）。限制性内切酶及其他有关试 点 （ＱＴＬ）的候选基因 。本研究通过对牦牛 ＣＡＰＮ１ 基因进行克隆和测序的基础上，与 ＧｅｎＢａｎｋ中已刊登 剂（上海生物工程有限公司）。 １．２　方　法 的普通牛、人、猪、鼠、鸡等物种的ＣＡＰＮ１