抗生素诱导嗜麦芽窄食单胞菌临床株外排泵SmeDEF表达的研究.pdfVIP

潍坊医学院学报 2013年 第 35卷 第 2期 101 得性耐药及插入序列 ISCRs介导的耐药机制。鉴于嗜 20h。细菌 RNA 的提取按照 UNIQ一10柱式 Trizol总 麦芽窄食单胞菌对多种抗菌药物 固有耐药，临床上常 RNA抽提试剂盒操作步骤，紫外分光光度计测 A260／ 用复方新诺 明(磺胺 甲基异嗯唑／甲氧苄啶)作为首选 A280值 ，定量后取2个稀释度(0．5，0．05g／L)的RNA 治疗药物。近年研究显示，复方新诺明的耐药率正逐 溶液进行 RT—PCR，扩增 SmeD基 因5端 的395bp片 年升高，与嗜麦芽窄食单胞菌的获得性耐药密切相关。 段 。反应上游和下游引物分别为：D15一CATGTIGCT． 同时有证据表明嗜麦芽窄食单胞菌的多重外排泵不仅 GAGCCGAATCC一3 ：D2 5一CAAGAGCCTITCCGTCAT一 是其固有的耐药机制，同时也是其获得性多重耐药的 3。引物由生物工程(上海)有限公司合成。反应条件 最重要原 因。现报告如下 ： 为：94~C变性 1．5rain，然后进行 30个扩增循环 ：94℃， 0．5rain；58cI=退火 1min；68oC延伸 1．5min；68oC，5min 1 材料与方法 充分延伸。从 3组孵育的细菌中提取 RNA在2个浓 度下扩增，产物进行琼脂糖 电泳和亮度对 比，了解 1．1 材料 菌株来源：嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株 SmeD的表达情况 。以嗜麦芽窄食单胞菌 B一内酰胺酶 来 自潍坊市人民医院细菌室，分别取 自呼吸内科肺部 L2的基 因 bala2的 258bp片 段 (上 游 引物 ：5． 感染患者的痰液。铜绿假单胞菌 ATCC27853和大肠 CGTCGCCGATFCCTGCAGTF．3；下 游 引 物 ：5一1Tr— 埃希菌ATCC25922作药敏试验质控菌。抗菌药物和 GAAGGTGCTGCACATC一3)为 内参进行 RT-PCR，RNA 主要化学试剂：抗菌药物为左氧氟沙星和复方新诺明； 约为0．5g／L。 分别购 自潍坊市人 民医院以及美 国奥齐戈纪念医院； 泵抑制剂 CCCP购 自美国SIGMA公司。培养基为 LB 2 结果 肉汤、MH琼脂为上海生工公司产品。UNIQ一10柱式 Trizol总 RNA抽提试剂盒、RT．PCR系统、Marker(DL． 2．1 实验菌株的耐药特性 所选两株嗜麦芽临床分 2000)、琼脂糖购 自上海生工公司。 离株基础病分别为慢性阻塞性肺病及肺癌，经纸片法 1．2 方 法 检测耐药表型和一般特性均对左旋氧氟沙星、米诺环 1．2．1 左氧氟沙星及复方新诺明的MIC值 采用 肉 素、复方新诺明敏感 。 汤稀释法。取 MH琼脂平皿上过夜生长的单菌落，接 2．2 左氧氟沙星诱导前后MIC值 采用常量 肉汤稀 种于LB肉汤培养基中，35 孵育6h，用 LB肉汤调整 释法测量左氧氟沙星及复方新诺明的MIC值，以铜绿 菌液浊度至0．5麦氏比浊标准，后将菌液 以1：10比 假单胞菌ATCC27853为质控菌株。质控菌株MIC值 例稀释 ，分别加入含有 LB肉汤和左氧氟沙星及复方 位于质控范围内，肉眼判断 MIC值。将 2株嗜麦芽窄 新诺明的试管中，各管中抗生素的浓度倍比稀释，各管 食单胞菌临床分离菌株经左氧氟沙星过夜孵育，再次 中终液体量为2ml，后分别加入稀释好的菌液 100jxl， 测定MIC值，其中1株对左氧氟沙星的MIC值比诱导 共 2．1ml。35oC孵育20h，读取MIC。 前的 MIC值高 2个稀释