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BRP44基因对前列腺癌生物学行为的影响 作者：袁刚，李黔生，靳风烁，蒋小娟，吴 刚 作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科，重庆 400042 【摘要】 目的 研究BRP44高表达的人前列腺癌细胞PC3细胞系(雄激素非依赖性前列腺癌细胞株)细胞的生物学性状的影响，以了解其在人前列腺癌发生发展中可能的机制和作用。方法 将已转染BRP44的PC3细胞提取其RNA，进而行Northern Blot检测证明其高表达，用Alamar Blue检测BRP44高表达的阳性细胞生长情况，流式细胞仪检测其细胞周期变换，采用改良的Transwell侵袭小室方法检测细胞侵袭能力。结果 BRP44高表达的PC3细胞增殖速度较转染空载体的PC3细胞和正常PC3细胞快，差异有统计学意义(P0.05)。在体外细胞移动实验中，BRP44高表达的PC3细胞也较另两组细胞表现出更强的穿膜能力、侵袭力(P0.01)。结论 BRP44表达增高与人前列腺癌细胞的恶性表型具有密切相关性，BRP44可能在人前列腺癌的发生、发展中发挥重要作用。 【关键词】 BRP44；人前列腺癌；PC3细胞；增殖；侵袭 前列腺癌是全世界特别是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤和主要死亡原因之一。我国随着人口老龄化、生活习惯及医疗检测水平的提高，目前发病率正逐年上升。我们基于SAGE数据库获得了前列腺癌与正常组织的差异表达基因，确定功能完全未知的BRP44基因为进一步研究的兴趣基因。通过Northern Blot实验证实：BRP44在前列腺癌细胞(LNCaP)中高表达而在PC3细胞中不表达。通过生物信息学方法，我们初步推断BRP44可能是一个在转录或翻译水平控制肿瘤细胞线粒体某些基因表达的调控因子[1]。RNA干扰实验证实BRP44基因对LNCaP细胞(雄激素依赖性前列腺癌细胞)的生长增殖起着负向调节作用。而在前列腺癌细胞PC3细胞(雄激素非依赖性前列腺癌细胞)中不表达。因此我们通过转染使BRP44基因在PC3细胞中高效稳定表达，研究BRP44PC3细胞的生物学性状的改变，初步了解BRP44基因的功能。 1 材料与方法 1.1 材料 PC3细胞系购买于中国科学院上海细胞研究所；细胞培养用的培养基小牛血清＋1640培养基(Hyclone公司),DNA限制性内切酶BamHⅠ、EcoR Ⅰ(TaKaRa公司)，PCR所用试剂(TaKaRa公司)，pcDNA3.1/mycHis A(大坪医院吴刚博士馈赠)，alarmar blue(SAGE公司)。 1.2 稳定高表达的PC3细胞系的建立及鉴定 采用pcDNA3.1/mycHis A载体与BRP44构建成重组子，pcDNA3.1/mycHisA载体与BRP44配合脂质体Lipofectamine 2000转染PC3细胞。预实验发现按5000细胞/皿稀释的3.5cm培养皿的细胞单克隆数量最为理想，于超净工作台上用20ΜL微量移液管管尖压住细胞克隆，将细胞克隆移至24孔板，胰酶消化后继续用含300Μg/L的G418培养基培养，5-8d后转入6孔板，待细胞长到80%后转入25cm2培养瓶，培养稳定传代后一部分冻存[2]。 对于外源基因转录表达强度的检测，一般采用Western Blot或者ELISA检测其蛋白表达的强弱，由于BRP44是一条功能完全未知的基因，无现成的的抗体可用。Northern Blot是分析mRNA表达丰度的可靠方法，由于该方法直接检测mRNA，不需反转录过程，只要保证RNA提取的质量及转膜的效率即可，因此以GAPDH为参照的定量分析结果的可靠性远优于RTPCR[3]。采用RTPCR和Northern Blot两种检测方法对转染后的细胞亚克隆进行检测，均可达到预期效果[4]。 1.3 Northern检测 将已转染成功的PC3细胞培养稳定。按照Trizol试剂说明提取细胞总RNA，经过分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测质量，选用合格的RNA样本进行分析。在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行RNA电泳，每个加样孔点10Μg RNA，8V/cm电泳3h。上行毛细管转移法将RNA转移至带正电荷的尼龙膜上[5]，转移12h后80℃烤干2h进行杂交。采用cDNA Prime试剂盒随机引物法合成BRP44的同位素标记探针。杂交12h后放射自显影48h洗片。 1.4 细胞增殖的测定 将处于对数生长期的稳定高效表达BRP44的PC3细胞(A组)和正常PC3细胞(B组)分别用胰蛋白酶消化后并细胞计数；按每孔200ΜL(控制细胞密度为2000细胞/孔)分别将A组和B组细胞种植于96孔板中，