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病毒诱导基因沉默MADS-Box基因胚珠启动子表达分析论文 【提示】本文仅提供摘要、关键词、篇名、目录等题录内容。为中国学术资源库知识代理，不涉版权。作者如有疑义，请联系版权单位或学校。 【摘要】本研究从无核葡萄败育过程的胚珠全长cDNA文库中分离克隆与无核葡萄胚珠发育相关的MADS-Box基因，分析其在葡萄不同器官和胚珠发育不同阶段的表达变化，获得无核葡萄胚珠特异表达基因和无核葡萄胚珠发育过程差异表达基因。将差异表达基因构建病毒诱导基因沉默表达载体，采用农杆菌介导法转化番茄，通过对侵染后番茄果实的检测和鉴定，初步明确这些MADS-Box基因的功能。同时，克隆胚珠特异表达MADS-Box基因的启动子序列，分析该序列中的顺式作用元件并构建缺失片段植物表达载体，转化拟南芥研究该启动子活性。取得的主要结果如下：1．以无核葡萄胚珠败育过程全长cDNA文库库液为模板，利用A-T克隆法得到7个MADS-Box基因。分别命名为VtMADS1、VtMADS2、VtMADS3、VtMADS4、VtMADS5、VtMADS6、VtSVP。序列分析表明，所有的基因均含有植物MADS-Box基因高度保守的MADS结构域和K结构域，属于典型的MIKC型MADS-Box基因家族。构建系统进化树进一步将这7个MADS-Box基因进行划分，VtSVP基因属于B类亚家族；VtMADS1、VtMADS2和VtMADS3基因属于C/D类亚家族；VtMADS4、VtMADS5和VtMADS6基因属于E类亚家族。2．采用半定量PCR对这7个MADS-Box基因在无核白葡萄和黑比诺葡萄不同器官进行了表达差异分析发现，基因在葡萄不同组织器官中表达模式存在差异：其中VtMADS1基因只在胚珠中特异表达；VtMADS2、VtMADS3、VtMADS4、VtMADS5、VtMADS6基因在花和胚珠中表达，而在根、茎、叶中不表达；VtSVP基因则在根、茎、叶、花和胚珠中均有不同程度的表达。因此，获得1个葡萄胚珠特异表达MADS-Box基因。3．采用实时定量PCR对这7个MADS-Box基因在无核白和黑比诺葡萄胚珠发育不同阶段进行了表达差异分析，结果表明：不同MADS-Box基因在有核和无核葡萄胚珠发育过程中有着不同的表达变化趋势。其中VtMADS1、VtMADS2、VtMADS4和VtMADS5基因在无核白和黑比诺胚珠发育过程中表达趋势基本一致，而基因VtMADS3、VtMADS6和VtSVP在两种葡萄胚珠发育过程中呈现不同的变化趋势。因此，获得了这3个在无核、有核葡萄胚珠发育过程中差异表达的MADS-Box基因。4．将无核、有核葡萄胚珠发育过程中差异表达的MADS-Box基因VtMADS3、VtMADS6和VtSVP构建病毒诱导基因沉默载体，RT-PCR对侵染后番茄进行了转录水平检测和种子表型分析，结果表明病毒侵染后的番茄果实中目的基因的表达量与对照相比明显降低，种子数量明显减少。说明目的差异表达基因可能与番茄果实发育中种子发育有关。5．以已验证的只在葡萄胚珠中特异表达的MADS-Box基因为基础，PCR扩增得到该基因上游1780bp调控序列，序列分析发现该启动子序列中含有多个与胚珠发育相关的顺式作用元件：P-box、TATC-box赤霉素响应元件；胚乳特异表达元件GCN4、Skn-1；GARE-motif赤霉素信号调控响应元件等。构建与GUS基因融合的缺失片段植物表达载体，农杆菌介导转化拟南芥，并获得T1代种子，为今后进一步研究启动子活性奠定基础。 【关键词】无核葡萄；病毒诱导基因沉默；MADS-Box基因；胚珠；启动子；表达分析； 【篇名】无核葡萄胚珠发育相关MADS-Box基因的克隆与功能分析 【目录】无核葡萄胚珠发育相关MADS-Box基因的克隆与功能分析 摘要 6-8 ABSTRACT 8-9 第一章 文献综述 12-22 1.1 葡萄无核基因的研究进展 12-13 1.1.1 无核葡萄的类型 12 1.1.2 种子败育型无核葡萄胚珠败育机理研究 12-13 1.1.3 葡萄无核基因的克隆与功能分析 13 1.2 MADS-Box基因研究进展 13-18 1.2.1 MADS-Box基因家族概述 13-16 1.2.2 葡萄中MADS-Box基因的研究进展 16-18 1.3 种子特异启动子研究进展 18-19 1.4 植物转录因子的研究方法 19-20 1.4.1 植物转录因子基因的克隆 19 1.4.2 植物转录因子基因的功能分析 19-20 1.5 本研究目的与意义 20-22 第二章 无核葡萄胚珠发育相关MADS-Box基因的克隆与表达分析 22-33 2.1 材料与方法 22-26 2.1.1 材料 22-23 2.1.2 方法 23-26 2.2 结果与分