E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定.pdfVIP

口腔生物医学2011年3月(第 鲞箜 塑! 旦 ：∑： ． !：Q · l7 · [文章编号] 1674—8603(2011)0l_0017-05 E2F一1基因RNAi慢病毒载体 的构建与鉴定 江 飞，袁 华，丁思阳，牛玉明，杜一飞，陈 宁 (南京医科大学口腔医学研究所 ·附属 口腔医院口腔颌面外科，江苏 南京 210029) [摘要] 目的：构建和鉴定靶向E2F一1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法：体外合成两对互补并编码靶向E2F一1基因的特异 性短发夹 RNA(shorthairpinRNA，shRNA)序列和一个阴性对照组的寡核苷酸，克隆到 pLKO．1一PURO—U6(AgeI／EcoRI)质粒 载体中．经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确，将 以上质粒分别和包装质粒混合物共转染 293T细胞．包装产生病毒 颗粒。各组病毒载体转染Tcaal13细胞后，运用Real—TimePCR和Western检测三组E2F一1mRNA和蛋白的表达水平。结果： 经酶切和测序证明，pLKO．1一PURO—U6一E2F一1shRNA序列正确；转染后，各组慢病毒载体中，第一组质粒感染后的Tca8113细胞 中E2F一1基因的核酸 电泳条带明显减弱，Western检测出E2F一1蛋白的表达降低。结论：靶向E2F一1基因的shRNA慢病毒载体 构建成功，并可特异性沉默 E2F一1基因的表达，为研究E2F一1在 口腔鳞癌的发生发展中的作用提供了初步的实验基础。 [关键词] E2F一1；RNA干扰；口腔鳞癌 ；慢病毒载体 [中图分类号] Q782 [文献标识码] A [doi] 10．3969／j．issn．1674—8603．2011．01．004 Constructionandidentification oflentiviralvectorofRNA interferenceofE2F一1gene JIANGFei，YUANHua，D1NGSi—yang，Mf／ -uring，DUYi ，CHENNing．(InstituteofStomatology，DepartmentofOraland MaxillofacialSurgery，SchoolofStomatology，Na ngMedicalUniversity，Na ng210029，China) Correspondingauthor：CHEN Ning，Email：ningchen09@ gmail．COBb， f：0086—25 [Abstract] Objective：Toconstructalentiviralvector—mediatedRNAinterference(RNAi)oftargetinggeneE2F一1．Methods：Two shorthairpinRNA oligonucleotidestargetinggeneE2F一1onappropriatesiteandonepairofnegativecontrololigonucleotidesequence weresynthesizedandinsertedintopLKO．1一PURO—U6(AgeI／EcoRI)vector．ThesequencesofthreeplasmidswereidentifiedbyDNA sequencerandrestrictionendonucleasedigestion．Theserecombinantplasmidsweretransfectedintothe293T cellsalongwith lentiviral packingmixby lipofectamine2000 for the packageoflentiviralparticles．Then the lentiviralvectorparticlesweretranstected into Tca8113cellsandE2F一1expressioninthetransfectedcellswasassayedbyReal—TiIllePCRandWestern．Results：Itwasverifiedthat the specificDNA oligonucleotidewasclonedintothevectorsuccessfully．Inthefirs