CYP450+3A及其等位基因在体外药物代谢和药物相互作用中的对比的研究.pdf

CYP450 3A及其等位基因在体外药物代谢和药物相互作 用中的对比研究 中文摘要 参与大部分药物的代谢过程，也被称为混合功能氧化酶或单加氧酶。CYP3A被认为是 人类P450家族在某些器官中最主要的功能形式。约占肝脏中总P450含量的30％，参与 45％．60％常用药物在体内的代谢转化过程，包括氧化、过氧化或者还原等。CYP3A4和 同的代谢常数。而且由于这两者在个体中含量的不同，因此可能具有不同的药物代谢能 力。CYP3A4亚家族中由于基因、年龄、疾病状态等因素，酶活性之间具有明显的个体 差异，不仅表现在肝脏表达水平差异约40倍，且个体对药物的体内代谢能力也相差10 能是造成个体间药物代谢差异的一个重要因素。实验目的是：通过体外的对比研究，找 出CYP450 差异性存在的原因。 I和XhoI消化产 法在CYP3A4野生型基因中引入各等位基因的突变位点，利用酶Kpn 生插入片段，与含有同样酶切位点的大肠杆菌pYES2／CT载体进行连接，然后转化到大 肠杆菌中。通过氨苄青霉素抗性标记筛选出重组子，初步鉴定后，再通过测序确认，无 非同义突变后，转化入整合有POR基因的酵母菌株中，利用半乳糖诱导重组子在酵母 系统中进行表达，差速离心法制备得到微粒体。并用CYP3A的特异性反应：荧光底物 回归分析法计算出‰值和‰值，进而得到体外代谢的内在清除率CLint，以此为依据 比较各重组酶的代谢差异。与此同时，使用原生型和各突变株微粒体蛋白在两种检测系 统中分别对19种和6种药物进行筛选，求出其IC50值，研究药物抑制的相互作用。 结果：酿酒酵母表达体系是CYP450酶系理想的体外表达体系。体外酶动力学和药 丧失因此也无法进行后续的药物抑制实验。 值分别是0．012和0．036 药物除了那些对两者都不存在抑制的药物外，平均而言大部分药物对3A5．wT的IC50 是对3A4一、W的4倍。 地尔硫卓曲格列酮舍曲林维拉帕米氟西汀大扶康奥美拉唑红霉素来适可文 迪亚泰洛平普拉固=立普陀=华法林=万络=辛伐他汀=西咪替汀。药物对wT和各等位 各等位基因的抑制程度排序为：酮康唑地尔硫卓维拉帕米大扶康西乐葆万络，六 种药对、胛和各等位基因酶的抑制程度的排序为：WT木18术3母4。针对某种药物的 具体抑制情况，3A4多态性现象依然存在，且存在明显的底物依赖现象。氨基酸顺序不 同或者改变后，酶动力学特征发生明显改变，且对药物抑制的程度也发生了一定变化。 结论：等位基因和wT相比，氨基酸改变后，酶动力学特征与野生型有明显差异， 且对药物抑制的程度也发生了改变。此外，本实验成功构建了在酵母表达系统中高效表 达CYP3A重组酶的方法，表达出的重组酶具有活性高、稳定性好等特点。同时也建立 CYP450的研究奠定了良好的基础，除可以作为一种新药临床前高通量筛选的方法外， 而且也有助于推动临床个体化用药的发展。 关键词：CYP3A，等位基因，药物代谢，药物相互作用 Ⅱ of metabolismsand Comparativestudydrug drug-drug interactionsofhuman P4503Aanditsallelesinvitro cytochrome Abstract． form a ofheine-thiolate Objective：ThecytochromeP450(P450)enzymessuperfamily inhuman arethe involvedinthemetabolismof proteins liver，andmajorcatalysts