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中文摘要 SHIP基因在慢性粒细胞白血病发病中的作用及机制探讨 摘 要 背景：慢性粒细胞白血病(chronic leukemia)是一种获 myelogenous 得性多功能造血干细胞突变后克隆性恶性增生性疾病。CML的全球年发 发病率为0．36／10万人口，仅次于急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病 位居第3位。 近年来，随着分子生物学及临床医学研究的不断进步，CML的病因 学有了很大进展，尤其是Ph染色体，bcr／abl融合基因的发现及其相关研 究，为慢性粒细胞性白血病病因诊断及治疗作出了很大贡献。Bcr／abl是 一种抑制凋亡的基因，能通过抑制细胞凋亡，而使细胞数量增加，基因组 的内在不稳定性增加，使细胞容易发生第二次突变，bcr／abl造成粒细胞恶 性增殖的确切机制至今未完全明了。SHIP基因是近年新发现的一种 调控因子。本课题前期研究发现急性白血病患者存在SHIP基因突变，但 SHIP基因在CML发病中的作用，尤其是有关临床方面的研究国内外尚无 报道。本研究拟检测SHIP基因在慢性粒细胞性白血病患者的表达，探讨 不同时期慢性粒细胞白血病患者SHIP基因表达变化；2、应用干扰RNA 化；3、应用SHIP基因敲除小鼠检测SHIP基因缺失对小鼠造血功能的影 响细胞凋亡中的机制。 方法 1 2合成bcr／abl基因的特异性siRNA，并转染K562细胞； 3 构建SHIP乒转基因骨髓受体小鼠，比较野生型和敲除SHIP基因骨髓 小鼠的外周血常规、脾脏细胞学、克隆形成及骨髓细胞迁移能力改变； AnnexV／PI染色比较野生型(SHIP+／+)$1：1SHIP以小鼠骨髓细胞的凋亡情况； 中文摘要 4 Western blot检测敲除SHIP基因小鼠骨髓细胞Akt磷酸化水平。 结果 l SHIP基因在CML患者表达减低 mRNA表达明显减 FQ．PCR结果显示与正常人相比，CML患者SHIP 低，。 2 bcr／abl融合基因抑制SHIP基因及蛋白表达 2．1 封闭bcr／abl融合基因后K562细胞SHIPmRNA表达增加：应用 干扰RNA技术封闭K562细胞中bcr／abl融合基因的表达后，基因表达 (3．58+0．37)x105]，空白对照组[(1．52+0．37)x 105拷贝】，空白对照组非特异性siRNA干扰组表达无统计学 [(1．53+0．20)x 1)。 意义(P=O．8 3 敲除SHIP基因骨髓受体小鼠出现了类似白血病的脏器侵润及相 关血液学变化 3．1 SHIP以小鼠出现类似白血病脏器浸润的表现：移植后3个月后， SHIP基因敲除骨髓受体小鼠部分出现了下肢瘫痪的特殊表现，表现为软 瘫，不能支撑体重，对疼痛的反应与对照组小鼠无明显差别，提示仅为运 动功能受损，此现象与临床白血病患者中枢神经系统浸润的表现极为相 似。另外解剖小鼠发现，基因敲除骨髓受体小鼠肺脏和脾脏体积均较野生 型增大。 因敲除小鼠的外周血中性粒细胞比例明显增加，但早期细胞比例并不高。 外周血中未发现有原、早幼粒细胞。血常规检测发现两种小鼠外周血中性 中文摘要 粒细胞和淋巴细胞比例有所不同而白细胞总数无显著差异(具体见第3 部分表1)。 3．3 组织学表现为肺脏、脾脏中中性粒细胞及单核细胞高度浸润： 与野生型小鼠相比，SHIP乒小鼠肺脏部分区域明显实变，显微镜下观察实 变区有髓系细胞浸润，浸润的细胞主要集中在肺泡区，部分区域还有气管 腔内中性粒细胞的浸润。脾脏结构明显受损，正常淋巴细胞生发中心消失 红髓白髓界限消失。为大量髓系细胞侵润。 3．4细胞学检测发现SHIP基因缺失骨髓受体小鼠脾脏中性粒细胞 比例明显增加；外周血中性粒细胞比例亦增高：与正常小鼠脾脏细胞相比， SHIP基因缺失骨髓受体小鼠的脾脏和外周血中性粒细胞比例明显增加， 但外周血中未发现幼稚细