过氧化氢和维生素E对老年豚鼠耳蜗外毛细胞大电导钙激活钾通道作用的实验的研究.pdf

过氧化氢和维生素E对老年豚鼠耳蜗191毛细胞大电导钙激活 钾通道作用的实验研究 。，易巾军 摘 要 一位{‘ 2，幺1工务舻讳它? 目的：研究氧化剂过氧化氢(hydrogen ceCa2+-and K+ 觚丽丽谕ge-condHetance 簦塑适鲤塑遭【廊g voltage．activated 用机制，以及其如何调节外毛细胞的功能状态，从而影响某些老年性 内耳疾病的发生和发展，为临床防治老年性聋等内耳疾病提供某些新 的思路。方法：采用膜片钳单通道技术。1．外毛细胞的分离选择健 康花斑36月龄豚鼠50只，耳廓外形正常，无耳外伤，耳廓反射灵敏， 耳镜检查鼓膜未见异常，耳声反射存在，雌雄不论，迅速断头后取出 双侧听泡，将双侧听泡放于正常细胞外液中，在解剖显微镜下去除蜗 壳，保持膜迷路和蜗轴的完整，从蜗轴底部离断后，迅速将膜迷路放 入含Ⅳ型胶原酶的细胞外液中10～15分钟，酶消化结束后，放入正常 细胞外液中3～5分钟，然后放入预先用人纤维连接纯化蛋白处理过的 浴槽中，解剖显微镜下撕去螺旋韧带，将基底膜留在浴槽中并机械吹 打，分离出外毛细胞，静置lO～15分钟待其贴壁。2．通道电流记录将 急性酶机械分离的外毛细胞置于对称性高钾溶液中(细胞外钾[K+】o： 并选用以下分析指标：(1)电流幅值(Current of Time， 概率(Probability Open，Po)；(3)平均开放时间(MeanOpen Close To)；(4)平均关闭时间(MeanTime，Tc)。3．鉴别并分析通道通 过改变钳制电压，观察并记录在细胞贴附式和内面向外式下BKCa通 道开放的电压依赖性，然后改变浴液中钙离子的浓度，使其依次达到 观察和记录通道开放的钙离子敏感性；然后使用BKCa通道阻滞剂 流幅值的变化。4．药物作用观察(1)本次实验中浴槽内浴液2ml， 在形成高阻封接后，采用细胞贴附式记录，依次向浴槽内加入不同浓 度的H202，使浴液中的药物终浓度依次达．100黼—OO—gmo!／L一, 作用，然后用不含药物的浴液灌洗，观察通道的恢复情况；(2)在观 察到3009mol／LH202对BKCa通道的作用后，不洗脱，加入不同浓 结果：1．在对称性高钾溶液中，内面向外式记录到电导为 随电压增加而增加，反转电位为OmV；在浴液中加入不同浓度的钙 离子后，BKCa通道被明显激活且具有钙浓度依赖性，Po明显增加； 在加入阻断剂TEA后，通常电流幅值Am呈浓度依赖性下降，在TEA H202能增加老年豚鼠单离耳蜗外毛细胞BKCa通道的活性， 1 VitE能下调H202引起的BKCa通道活性的增加。结论： 509mol／L 1．本实验测得的电流为大电导钙激活钾通道BKCa，具有大电导，钙 浓度的H202能增加豚鼠单离耳蜗外毛细胞BKCa开放的概率，而适 宜浓度的VitE能下调H202增加的豚鼠单离耳蜗外毛细胞BKCa电流。 3．实验结果证明，H202和VitE从离子通道水平参与了耳蜗外毛细胞 的损害和保护，并且胞内机制可能参与了它们的作用发挥。4．根据 实验结果推测，H202和VitE可能参与了老年性聋的发病过程，为老 年性聋的抗氧化治疗提供了进一步的理论支持。 关键词：过氧化氢；维生素E；大电导钙激活钾通道；耳蜗；外 毛细胞；膜片钳单通道技术 Effectof and on Q—tocopherolHigh—conductance hydrogenperoxide