丝状真菌米曲霉外源基因表达系统构建.pdfVIP

华 南 理 工 大 学 学 报 (自然科 学版 ) 第37卷 第6期 JournalofSouthChinaUniversityofTechnology V0l|37 NO．6 2009年 6月 (NaturalScienceEdition) June 2009 文章编号 ：1000-565X(2009)06—0084．07 丝状真菌米曲霉外源基因表达系统的构建水 王斌 潘力 郭勇 (华南理工大学 生物科学与工程学院，广东 广州510006) 摘 要：以米曲霉 (Aspergillusoryzae)RIB40的基 因组 DNA为模板，聚合酶链式反应 (PCR)扩增得到启动子、终止子、筛选标记基因等表达元件 ，依次连接到载体 pUC119上， 构建了米曲霉的重组表达载体pNMA．将米赫根毛霉脂肪酶基因(RML)连接于pNMA的 启动子下，得到表达载体pNMA-RML，通过ApaI酶切线性化转化米曲霉宿主茵A．oryzae niaD300，得到整合型的阳性转化子A．oryzaeONL1．其培养7天的培养液的上清液在以三 丁酸甘油酯为底物的平板上形成清晰的水解透明圈，碱滴定法酶活测定表明培养液酶活 可达2．5U／mL，培养液上清液的十二烷基硫酸钠 一聚丙烯酰胺凝胶 电泳 (SDS)图 谱在相对分子质量32500处有RML的特征条带．这说明RML已经在米曲霉中成功表达， 同时证明所构建的米曲霉外源基因表达系统是有效的． 关键词：米曲霉；外源基因表达；米赫根毛霉脂肪酶；硝酸盐还原酶；标记基因 中图分类号：Q782 文献标识码：A 米 曲霉 (Aspergillusoryzae)是丝状真菌中应用 硝酸盐还原酶基 因(niaD) 、ATP硫酸化酶基因 非常普遍的种属，具有高效的蛋白分泌表达能力，不 (sC) J、鸟氨酸氨 甲酰基转移酶基因(argB) 等． 产生黄曲霉毒素等有毒物质，应用历史悠久，是公认 米曲霉表达系统主要应用于米曲霉 自身生理状态的 的GRAS菌，广泛应用于食品酿造行业、工业酶制剂 研究 J．国内对米 曲霉表达系统的研究 尚未见报 行业．目前为止，利用米曲霉表达异源蛋 白的水平可 道．本研究选用高效的基因表达元件构建米 曲霉的 达3g／L_】J，与真核蛋 白的优秀表达系统毕赤酵母的 外源蛋白表达系统，并对其进行初步鉴定，为利用米 表达水平相当 ]．除此之外，米 曲霉蛋 白表达系统 曲霉高效表达外源蛋 白打下基础． 具有完善的蛋 白翻译后修饰机制，其模式接近于高 1 材料与方法 等真核生物，能高效实现蛋 白质的肽链剪切、糖基 化、形成二硫键、折叠成特定空间结构等翻译后修 1．1 材料 饰．因而，构建高效的米 曲霉外源蛋 白表达系统的 1．1．1 茵株和质粒 研究 日益受到重视． 米曲霉营养缺 陷型宿主菌 (Aspergillusoryzae 目前关于米曲霉表达系统的研究主要集中于启 niaD300，niaD一)由日本 NRIB研究所惠赠，米 曲霉 动子、筛选标记基因等的鉴定方面．已确定的高效启 RIB40购 自日本NBRC菌种保藏中心，含有米赫根毛 动子包 括淀 粉酶 基 因 (amyB)[3J、糖 化酶 基 因 霉脂肪酶基因(RML)的质粒 pICAS1一RML由华南理 (glaA)J、葡萄糖苷酶基因(agdA) 、酪氨酸酶基 工大学生物科学与工程学院微生物酶工程实验室惠 因(melO) 等的启动子，高效的筛选标记