实验设计周四2-3生51丛乐生53王成.pdfVIP

PTEN 基因的克隆及蛋白质的表达 生 51 丛乐 生 53 王成 PTEN 基因的克隆及蛋白的表达 生 51 丛乐 2005011007 生 53 王成 2005012337 一、背景介绍 A 、研究背景及意义 B 、基因信息 1、基本信息 2 、序列信息 二、实验方案 A 、流程图 B 、实验过程 1 、总RNA 的提取 2 、RT—PCR 3、重组体的构建 4 、重组体转化、克隆鉴定 5、酵母的转染 6 、SDS鉴定 三、实验预期结果 四、参考资料 五、作业总结 第 1 页 共 17 页 PTEN 基因的克隆及蛋白质的表达 生 51 丛乐 生 53 王成 一、背景介绍 A 、研究背景及意义 PTEN是于1997年被发现一个重要的抑癌基因。PTEN特异性地使磷脂酞肌醇-3,4,5一三磷 酸〔PtdIns(3,4,5)P3〕去磷酸化，参与调节细胞生长、增殖及胞外基质相互作用。由于许 多癌基因产物是蛋白激酶，而磷酸酶常常拮抗蛋白激酶的效应，但一直不能直接证实磷酸酶 在肿瘤发生中的作用，对PTEN的研究首次确证缺乏磷酸酶活性将增加肿瘤发生的危险性，因 此，PTEN被认为是继pRb,p53后的又一重要的肿瘤抑制基因。 PTEN作为磷酸酶，特异性地使磷脂酞肌醇-3,4,5一三磷酸 〔PtdIns(3,4,5)P3]及磷脂酞 肌醉-3,4一二磷酸〔PtdIns(3,4)P2〕的肌醇环D3去磷酸化，分别生成PtdIns(4,5)P2和 PtdIns(4)P。这些D3磷脂是磷脂酞肌醇3-OH激酶(phosphatidylinositide3-OH kinase,PI3K) 的直接产物，PI3K/PtdIns( 3,4, 5) P3通过多种途径进行与细胞生长及存活有关的信号转 导。通过一些生长因子如血小板源性生长因子(PDGF),胰岛素样生长因子(IGF)、上皮生长因 子(EGF)的刺激，激活含有SH2区(Srch omology)的PI3K,PI3K的活化底物PtdIns(3,4,5)P3 与含有PH的同源结构域(Pleckstrin homology)的Ser/Thr激酶AKT(亦称PKB或RAC1)结合，此 时AKT的构型发生改变，使Thr34$及Ser473被磷酸化而激活，这两个残基分别被3-磷脂酞肌 醇依赖性激酶(PDK1)及整合素关联激酶(integrin-linkedk inase,IL K)磷酸化,AKT相关的 细胞存活机制包括多种途径，如生长因子、细胞素、c-myc的过表达、紫外照射及基质分离。 由于拮抗了PI3K/AKT信号系统，PTEN具有诱导细胞死亡及细胞周期阻滞的作用。 PTEN 诱导生长抑制可能有两种机制:①促进细胞周期阻滞在G1期;②通过多种刺激的诱 导加速细胞的凋亡。除了上述的细胞周期阻滞作用外，PTEN增加细胞的凋亡率亦起到抑癌作 用。在缺失PTEN的小鼠细胞中导人过表达的PTEN能增加细胞对紫外照射、热休克、辐射诱导 的