PCR实验技术基础知识.docVIP

PCR实验技术指南一、引物设计设计软件有很多，既可以在线设计（如Primer3 /cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi），也可以用Primer5、Oligo6.65 等等1. 引物设计的原则细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：1）典型的引物18 到24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 2）选择GC 含量为40％到60％或GC 含量与模板GC 含量接近的引物。 3）设计5端和中间区为G 或C 的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 4）避免引物对3末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。在用软件设计时大家常常会疑惑,究竟? G 不能低于多少?这里有个数据: ? G 为0~-2时,PCR 产率可达100%, ? G=-6 时,为40%. 5）避免3末端富含GC。设计引物时保证在最后5 个核苷中含有3 个A 或T。 6）避免3末端的错误配对。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化