RNA病毒反向遗传学的研究方法和应用.pdfVIP

专论与综述 RNA病毒反向遗传学的研究方法和应用 王 煜,张七斤* (内蒙古农业大学动物科学与医学学院,呼和浩特 ) 010018 摘 要:本文介绍了 病毒反向遗传学的主要研究方法, 病毒反向遗传技术的最新研究进展及其在分子病 RNA RNA 毒研究和疾病防制种的应用及发展前景,着重介绍了感染性克隆构建的过程和拯救病毒时可能会遇到的问题。 关键词: 病毒;反向遗传学;病毒拯救 RNA 反向遗传系统可以对 RNA病毒直接进行遗传操作,为 所需要的各种必要条件。目前,对不同的RNA病毒反向遗传 RNA病毒的分子生物学研究提供了一种强大的工具。反向遗 系统的构建没有固定的程序,但有基本的构建原则。一般来 传操作技术 通常被称为 “病毒拯救( 说,对长度较小 以下 的正链 病毒, 稳定地扩 (ReverseGenetics) the (15kb ) RNA (1) rescueofvirus)”,它是指在病毒 cDNA分子水平上进行体 增 cDNA,可以先通过 RT-PCR扩增出病毒 cDNA,再拼 外人工操作,采用病毒的遗传材料,在培养细胞或易感宿主 接成全长,然后体外转录获得 。 由 转录的 cRNA (2) cDNA 中重新拯救 出活病毒或类似病毒物质,如进行基因点 有高特异性的感染性,全长的 模板一般由质粒 (rescue) cRNA cDNA 突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等方法人为构建有感染 扩增后,在体外利用噬菌体的 或 多聚酶进行 SP6 T7RNA 性RNA的技术,以此来研究RNA病毒的基因复制与表达调 转录,获得感染性克隆,但大多数黄病毒的cDNA克隆对细 控机理、特定的蛋白结构和功能、 编辑和自发重组与诱 菌宿主有害,是其扩增的主要障碍。此外,设计的模板应尽可 RNA 导重组、病毒与宿主间的相互作用关系、抗病毒策略、基因治 能与病毒基因组一致,包括完整的末端结构、不带多余的碱 疗研究,以及构建病毒感染性克隆载体和进行疫苗的研制 基、 端结构和获得高水平 的适当转录条件。所得到的 5′ RNA 等。该技术的产生大大加快了RNA病毒在分子水平上研究 RNA可转染适当宿主细胞,也可直接接种敏感动物,拯救 进程,自1978年第一例RNA病毒QR噬菌体的成功拯救以 出活病毒。对于负链 RNA病毒、基因组长度较大的正链 来,各类RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展,尤 RNA病毒如冠状病毒,一般遵循以下“三步流程”:第一,获 其是通过反向遗传学技术拯救的负股 RNA病毒的成功,是 得一些在体外细胞培养系统中自然产生的亚基因组RNA成 近 年来分子生物学领域最令人鼓舞的一项成果,它开启 分 , 或 缺损干扰 10 (sub2genomicRNAS sgRNAs)