实验一染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列_final.pptVIP

现代微生物学实验技术 马 玉 超 北京林业大学生物科学与技术学院 办公地点：生物楼117；电话 Email:myc0307@ 实 验 内 容 ? 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ? 转座子随机突变及目的表型的筛选 ? 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导 ? 利用SDS分析融合蛋白的可溶性 ? 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取 用户名：xdwswsy@126.com 密码：112233445566 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 —TAIL-PCR 牛伯庆 许梦秋 实验目的 掌握TAIL-PCR的原理，增强对PCR重要性的认识； 掌握TAIL-PCR的实验流程，为将来课题研究奠定基础。 a hot arbitrary degenerate primers: AD1：5′-TG(A/T)GNAG(A/T)ANC(G/C)AGA-3′； AD2：5′-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3′； AD3：5′-CA(A/T)CGICNGAIA(G/C)GAA-3′； AD4：5′-TC(G/C)TICGNACIT(A/T)GGA-3′。 TAIL-PCR 的原理 sp1 sp2 sp3 已知序列 未知序列 特异引物序列： sp1:TGGAGAACTT GTAACCCTTG GTG sp2:TGGCGAGTGAGACGACGAGT sp3:CGAGCAGATGGTTCTTGG TAIL-PCR:Thermal asymmetric interlaced PCR Liu et al., 1994 TAIL-PCR 的原理 实例：微生物法生产丙烯酰胺 最简单和最重要的酰胺化合物 丙烯酰胺 聚丙烯酰胺：百业助剂 采油 水处理 造纸 其它 微生物法生产丙烯酰胺 氮代谢网络 Pseudomonas Bacillus Rhodococcus NHase Nitrile Hydratase (NHase) 课题背景-腈水合酶代谢酶系研究进展 腈水合酶代谢酶系研究进展 Rhodococcus rhodnii DSM43336T (X80621) Rhodococcus corynebacterioides DSM 20151T (X80615) Rhodococcus rhodochrous DSM 43241T (X79288) Rhodococcus gordoniae DSM 44689T (AY233201) Rhodococcus terrae DSM 43249T (X53202) Rhodococcus globerulus DSM 43953T (X80620) Rhodococcus coprophilus DSM 43347T (X80626) Rhodococcus roseus ATCC 271T (X81921) Rhodococcus pyridinivorans DSM 44555T (AF173005) Rhodococcus phenolicus DSM 44812T (AM933579) Rhodococcus zopfii ATCC 51349T (X81934) Rhodococcus ruber strain TH Rhodococcus ruber DSM 43338T (X80625) Rhodococcus aurantiacus DSM20162T (X80628) Rhodococcus obuensis DSM 43896T (X80634) Rhodococcus bronchialis DSM 43247T (X79287) Rhodococcus kyotonensis JCM 23211T (AB269261) Rhodococcus fascians ATCC 12974 T (X81930) Rhodococcus erythropolis ATCC19566T (NSU82667) Rhodococcus qingshengii KCTC 19205T (DQ090961) 100 84 99 78 100 79 84 100 56 100 100 100 52 82 99 100 0.1 Rhodococcus chlorophenolicus DSM 43826 T (X79292) Nocardia asteroides ATCC 19247T (DQ659898)