高效液相层析法 及其在生化研究中的应用课件.pptVIP

高效液相层析法 及其在生化研究中的应用 03级 化学生物专业 李楠 高效液相层析法（HPLC,high performance liquid chromatography）是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。由于HPLC分离能力强、测定灵敏度高,选择性高，分析速度快，可在室温下进行，应用范围极广，无论是极性还是非极性，小分子还是大分子，热稳定还是不稳定的化合物均可用此法测定。对蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤为有利。 层析法的本质 色谱柱高选择性的高效能的分离作用与高检测技术的结合。混合组分的样品在色谱柱中分离的依据是：同一时刻进入色谱柱中的各组分，由于在流动相和固定相之间溶解，吸附或离子交换等作用的不同，随流动相在色普柱中运行时，在两相间进行重复多次（103－106）的分配过程，使原来分配系数具有微小差别的各组分产生了保留能力明显差别的效果。进而各组分在色普柱中移动速度不同，经过一定长度的色普柱后，彼此分离开，最后按顺序进入信号检测器，在记录仪上或色普数据机上显示出各组分的色普行为和谱峰数值。 层析法可用于定性，半定量，定量的测定。其定性分析的依据是出峰的时间。而定量的依据是；组分重量或在在载气中的浓度与检测器的响应信号成正比。此响应信号指峰面积或峰高，表示为wi=fiAi, wi为欲测组分i的量， Ai为组分i的峰面积， fi为比例系数 （称校正因子） 　 高效液相层析法的基本概念和分离理论与经典的液相色谱法及气相色谱法一致，因而其塔板理论及动力学理论等都可用于高效液相层析。 ?? ⒈ 高效液相层析仪 典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分。流动相用一高压泵输入。这种高压泵应满足以下条件： ①流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。 ②能抗溶剂腐蚀。 ③有较高的输出压力，一般要达到15－300kg/c，也有的高达800kg/c。 ④泵的死体积要小。梯度洗脱装置必须具备两台高压泵，一台输送强溶剂，一台输送弱溶剂，两泵运转速度用电脑控制，并可按一定的要求改变流动相的组成，以改善分离效果。 一般用微量注射器直接进样，也可采用六通阀门进样。HPLC中所用的检测器最多应用的是紫外吸收检测(UV)，灵敏度可达ng水平。此外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器等。 高效液相层析仪的结构简图 ⒉ HPLC的类型与应用 ⑴ 液-固吸附层析： 固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。液-固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同，分为“底剂”和洗脱剂两类，底剂起决定基本色谱的分离作用，洗脱剂起调节试样组份的滞留时间长短，并对试样中某几个组份具有选择性作用。流动相中底剂与洗脱剂成分的组合和选择，直接影响色谱的分离情况，一般底剂为极性较低的溶剂，如正已烷、环已烷、戊烷、石油醚等，洗脱剂则根据试样性质选用针对性溶剂，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分离异构体、抗氧化剂与维生素等。 ⑵ 液-液分配层析：固定相为单体固定液构成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上，经酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的液-液层析称为化学键合相层析。另一种利用离子对原理的液-液分配层析为离子对层析。 化学键合层析分： ①极性键合相层析：固定相为极性基团，氰基、氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极性较小的溶剂。极性小的组份先出峰，极性大的后出峰，这称为正相层析法，适用于分离极性化合物。 ②非极性键合相层析： 固定相为非极性基团，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基与苯基等，流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面的硅羟基，防止因吸附而至的拖尾现象。极性大的组份先出峰，极性小的组份后出峰，恰好与正相法相反，故称反相层析。本法适用于小分子物质的分离，如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生物等。 ⑶ 离子交换层析： 原理与普通离子交换相同。在离子交换HPLC中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。流动相 主要是水溶液，pH值最好在被分离酸、碱的pK值附近。 应用 高效液相层析法适用于分析沸点高，分子量大，热稳定性差的物质，它们约占全部有机化合物的80％，现在高效液相层析法已经在生物化学，生物工程，医药研究，食品分析，环境