双水相萃取法从风干香肠中分离提取蛋白酶.pdfVIP

维普资讯 第36卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究报告 第 7期 2008年7月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 90o一904 双水相萃取法从风干香肠 中分离提取蛋 白酶 张兰威 陈 一 韩 雪 杜 明 易华西 (哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，哈尔滨 150090) (东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030) 摘 要 双水相萃取(ATPS)是近年来发展起来的蛋 白纯化方法。为了扩展该方法适应领域 ，同时为风干香 肠形成过程酶系的研究提供具体方法。本实验研究了运用双水相技术分离提取风干香肠中蛋白酶，对构成双 水相体系中的PEG分子量、浓度和类 型以及盐浓度的影响进行了分析。确定了双水相组成体系为 20％ PEG1000(m／m)和 25％MgSO (m／m)，在此体系中风干香肠的蛋 白酶主要分布在上相，最高酶活 12．37U／ I．Lg；纯化倍数为4．61；回收率为85％。通过分子筛层析对比，表明风干香肠经过双水相分离提取杂蛋白峰被 除去，而蛋 白酶峰几乎未受到影响，说明该双水相体系萃取香肠中蛋 白酶具有 良好的专一性。调解双水相 pH 值对蛋白酶的萃取没有影响，而添加电解质NaC1反而产生不利影响。 关键词 双水相 ，蛋白酶，风干香肠，分离提取 1 引 言 蛋 白酶可作用于蛋白质或多肽肽键 ，对食品质量、风味、改善食品的营养起重要作用。获得纯化 的 蛋白酶的主要方法有：盐析法、专一性沉淀法和变性方法。但这几种方法只能得到蛋 白酶的粗制品，电 泳法虽然可以获得高纯度蛋白，但它易破坏蛋白质的生物活性。双水相萃取 (ATPS)技术是近年来发 展起来的一项蛋白纯化方法。该方法是利用一种聚合物和无机盐的混合溶液或两种水溶性不同的聚合 物，在一定浓度下体系分成互不相容的两相，由于表面性质、电荷间及各种作用力(如憎水键、氢键和离 子键)等因素的影响，使得 目标蛋白质和其它蛋 白质在两相间的分配系数不同，达到分离 目的 。近 年来，对离子型和非离子型表面活性剂双水相、表面活性剂／无机盐双水相的成相机理、界面性质、相行 为以及蛋白质在体系中的分配行为进行了深入的研究。随着新型双水相体系的发现，该方法获得的产 物活性高，已广泛应用于生物化工、医药化学、细胞生物学等领域 ，牛血清蛋 白(BSA)、牛酪蛋 白、 口哥L球蛋 白、血清蛋 白、9(／一淀粉酶和蛋 白酶、胆固醇氧化酶、脂肪酶、磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油 醛脱氢酶(GAPDH)、葡糖淀粉酶等都在双水相体系中得到较好的分离，将有希望在工业化生产中得到 应用 ]。但由于不同蛋白酶本身特性及所存在的环境差别，而双水相的组成又直接影响着 目标酶分配 系数、提取纯度和回收率 ，因此该方法在食品领域的相关研究还很少。 风干香肠在加工过程中因复杂的生物化学反应而形成独特风味，其中蛋 白酶引起蛋 白质降解产生 风味前体——游离氨基酸是风味形成的关键 l1J。对于风干香肠中蛋 白酶的研究，主要是通过香肠发 酵和成熟过程中氨基酸成分的变化和产物的形成来反推其作用。本实验采用双水相萃取技术从风干香 肠中提取蛋 白酶，通过对成相物质的组成、浓度、pH值、无机盐等影响因素的考察，建立一种简单可行的 分离提取风干香肠中蛋 白酶的方法，为研究风干香肠蛋 白酶的作用提供有效的途径。 2 实验部分 2．1 仪器与材料 TU一1800分光光度计 (北京普析通用有限责任公司)；LDZ5-2离心机 (北京医用离心机厂)；蛋 白纯 化系统AKTAPurifier(AmershamBioscienes)。 一 酪氨酸(amershampharmacia)为色谱纯，SephadexG一75为AmershamPharmacia产品，三羟甲基氨 基 甲烷(Tris)和酪蛋 白为 Sigma产品，各种聚乙二醇 (PEG800、PEG 1000、PEG2000、PEG4000、pEG 2007．10-26收稿 ；20o8 204接受 本文系黑龙江省教育厅科技攻关项 目(No．10511Z003)和黑龙江省十五科技攻关项 目(No