一种淀粉样蛋白电镜标本制备的新方法.pdfVIP

天津医药2007年4月第35卷第4期 287 新技术交流 一种淀粉样蛋白电镜标本制备的新方法+ 赵娟徐淑梅 关键词淀粉样B蛋白阿尔茨海默病 显微镜检查，电子 阿尔茨海默病(AD)的发病机制尚不确定且无特效治疗 在实验中笔者发现5此样本溶液滴于铜网上，空气干燥1 药物，普遍认为淀粉样蛋白(AB)产生和聚集是AD的重要病min后。仍然呈液滴状附于铜网的含碳膜一侧。延长干燥时 理学特征【11。在以A8为靶点进行体外实验阶段的药物研究 间至40min，样本溶液也不能完全被吸收。干燥lmin后进 过程中，通常采用透射电镜观察AB的形态改变来推断药物 行染色。不仅含碳铜网上吸附的样品比较少给后来的镜下观 能否抑制AB聚集，这也是体外间接了解药物治疗AD机制 察带来难度。而且残余的样本溶液对于染色液的稀释使得染 的一个重要方面闭。一般制备淀粉样蛋白的透射电镜标本时。 色质量下降，降低了标本的反差。 常会发生含碳铜网不能均匀和完全地吸附样本溶液的情况， 为了解决上述问题，本研究采用固一液一固态干燥，不仅 使标本上出现斑块盲视野区和无样本区。染色达不到预期的 避免了液一气表面张力对样本造成的损伤，又使样本溶液和 效果，电镜下观察淀粉样蛋白超微结构质量较低。为此，本研 碳膜更容易达到同液平衡．增加碳膜对于样本的吸附。处于 究提出了一种扣滴延时染色法，即：采用样本溶液扣滴，延长 铜网和蜡盘之间的液滴形状发生改变．增加了样本溶液和铜 样本与含碳铜网接触时间和延长醋酸双氧铀染色时间的方 网的接触面积，也有助于样本吸附，减少了标本的无样本结 法，并通过实验证明了这种新方法的有效性。 构区。将含碳铜网扣在样本溶液的液滴之上，可以防止样本 溶液中可能存在的大分子物质由于重力作用而沉降在含碳 1材料与方法 铜网上．有效地避免了可能由于这些大分子物质而形成的斑 1．1材料淀粉样蛋白(A％)，购自美国Sigema公司，纯度块盲视野区。笔者在实验过程中。延长了样本溶液和铜网的 接触时间闱，使目的样本在溶液和含碳铜网之间达到充分的 大于98％并经高效液相色谱分析法(HPLC)和基质辅助激光 解吸附飞行时间质谱(MALDI—TOFMS)检验。二甲基亚砜 平衡，增加样本的吸附，并且弥补了由于倒扣可能导致的样 本厚度不够的缺点。延长负染时间的目的在于增加样本的反 (DMSO)购自美国Sigema公司，纯度大于99．9％。MEM液体 差度。有利于辨认和观察淀粉样蛋白的结构。滤纸吸去多余 培养基购自Gibco公司，成分为MEM和去离子水。300目标 准圆孔微栅和含碳支持膜均购自美国EMS公司。 液体则可以使样本溶液在铜网上分布更均匀，铜网上的碳膜 1．2方法100燃A艮溶于200wLDMSO中，配成浓度 各区域紧张度保持平衡．提高了对大量高速电子束的冲击的 0．5dL的储存液．分装后一20℃备用。用时MEM稀释至浓度耐受性。本方法使淀粉样蛋白的电镜标本质量得到了提高， 50 mgCL。取5此样本溶液滴于蜡盘中，样本溶液呈液滴状，但还存在不足之处，如标本在长时间的观察后。含碳支持膜 将含碳支持膜铜网反扣于液滴上，有碳膜的面向下，与样本 仍然会发生破裂等问题，还需不断摸索完善。 溶液接触。室温静置15rnin。滤纸小心吸去多余液体。取适 (图1见插页) 量2％醋酸双氧铀于试管中，将铜网充分浸入染料中2rain。