PDCD5在大鼠心肌缺血一再灌注心律失常中的作用机制初探.pdfVIP

现代预防医学 2011年第38卷第6期 ModernPreventiveMedicine，201I． l1．38．NO．6 ·1097 · 存侧第五肋 问处切开胸壁并沿胸骨左缘 2lllm处切断第 四肋 ， 计 60s，记4分；出现室颤 (VF)，记 5分；⑥ 出现持续 5 切开心包膜 ．轻压胸壁挤出心脏 ，H{细小弯针在冠状动脉左前 nfin以上 的VF或在观察期 间死亡 ．记 6分。 降支下穿一根丝线，经此操作后 ，动物可能出现心律失常、血 1．3．4 心肌组织凋亡检测 (TUNEL法) 实验结束后 ，迅速 压下降，故需稳定 15min，才结扎冠状动脉。先在心脏表面垫 摘取心脏 ，用冰生理盐水冲洗后剪去心房、血管及脂肪组织 ， 一 段实心小塑料管 (直径 12mm)，结扎冠脉时把塑料管扎在 10％甲醛 固定 。心肌组织切片常规脱蜡水化，按试剂盒操作说 结内，缺血15min后 ，抽 出塑料管 ，恢复冠脉灌注 ，连续观测 明进行 TUNEL染色 ，成色反应后 ，常规脱水 ，二 甲苯透 明， 心电图一段时问，若不出现心律失常 ，则弃之不用 。至此 ，再 中性树胶封片 。光镜 下观察细胞核 中有棕黄 色颗粒者为 灌注心律失常 型制备完成。 TUNEL阳性细胞 ，在每例标本于 400倍镜下随机取 5个视野 ， 1．3．2 实验分组 取 Wistar·大鼠40只，随机分成 4组 ，每组 数 出每个视野 阳性细胞数及总的细胞数 ，以此计算细胞凋亡指 10只，分组处理如下：① 假手术组 (SH)：实验大鼠在手术 数 (apoptotieindex，AI)，AI= (阳性细胞数 ／总的细胞数)x 时只穿线不进行冠脉结扎 ；( 缺血一再灌注 10min组 (I／R 10 1oo％ 。 rain)：大 鼠冠脉结扎 15min再恢复灌注 10min；大 鼠③缺血一 1．3．5 实时荧光定量 PCR法检测PDCD5mRNA表达 大 鼠处 再灌注20rain组 (I／R20min)：大 鼠冠脉结扎 15min再恢复 死后 ，取左心室心尖部心肌 (非梗死区)放人 DEPC 处理的 灌注20min；④ 缺血一再灌注 30min组 (I／R30min)：大 鼠 EP管中保存于一80oC冰箱中备用。检测时称取心肌组织并用 冠脉结扎 15rain再恢复灌注 30min。实验结束后 ，即刻取 出 Tnzol提取总RNA，在紫外分光光度计测量 A260／A280，鉴定 大鼠心脏 ．用冰生理盐水冲洗 。分离左心室并将其分成 3份 ， RNA纯度及浓度 。根据 GeneBank中PDCD5、GAPDH 的基 因 1份直接放人 10％甲醛溶液中固定 。另 2份放入一80℃冰箱 中 序列设计引物用于荧光定量PCR检测 (见表 1)。反应条件为 ： 保存 以备实时荧光定量 PCR及 Westernblot检测所用 。 (1)54．5℃ (GAPDH 的复性温度为 50℃)，30min；94℃，2 1．33‘ 室性心律失常评分 参照 Ravingerova，T等_8j室性心律 min，1个循环 。 (2)94℃，45s；62．2~C，45s；72℃，2 失常 (VA)评分方法进行评分。标准如下：① 无VA或有5 min，共 40个循环 。 (3)72℃，8min，1个循环 。反应结束 次的室性早搏 (VE)，记 O分；② 仅有I5次的VE，记 1分； 后，电脑 自动分析荧光信号并将其转换为Ct值，并以GAPDH ③ 仅有一阵60s的室性心动过速 (VT)，记2分；(有一 作为对照计算 出 目的基 因的相对表达水平 。 阵--60s的或 多阵累计 60s的VT，记 3分 ；( 多阵 VT累 表 1 大鼠PDCD5及 GAPDH的基因引物序列 1．3．6 Westernblot法检测心肌 PDCD5蛋 白表达水平 从冰箱 注 1min即开始出现心律失常；其余 2组大 鼠也均出现心律失 中取出心肌组织称量后 ，提取心肌 总蛋 白，以BCA法进行蛋 常，类型也以室速 、室早、室颤为主 。但其严重程度均低于 L／ 白定量 ．经 5％积层胶