鲅鱼脑组织AChE的分离纯化及某些生化性质.pdfVIP

维普资讯 第21卷 第2期 青 岛大 学学报 (工 程技术版 ) V()I．2】No．2 2006年 6月 JOURNALOFQINGDAOUNIVERSITY (ET) Jun．2006 文章编号 ：1006—9798(2006)02—0035—07 鲅鱼脑组织AChE的分离纯化及某些生化性质 朱小山 ，孟范平 ，何东海 (1．南开大学环境科学与工程学院，天津 300071； 2．中国海洋大学海洋环境科学与工程学院，山东青岛266003) 摘要：采用亲和层析法对鲅鱼 [Scomberomorusniphonius(Cuvier)]脑组织的胆碱酯酶 [acetylcholinesterase(ACHE)，EC3．1．1．7]进行分离纯化，然后对其进行底物特异性、 过量底物抑制效应和抑制剂选择性检验 。结果证实：该酶为乙酰胆碱酯酶(ACHE)，其最 大 比活力为 297．82~／mol／(min·mg)，最佳pH范围在 7．0～8．0之间，最佳温度为30℃。 此酶经过 SDS—PAGE呈一条带，表明其纯度达电泳纯。 关键词：鲅鱼；乙酰胆碱酯酶；分离纯化；生化性质 中图分类号：Q556 文献标识码 ：A AChE是生物神经传导中的一种关键性酶，能高效水解神经递质乙酰胆碱，保证神经冲动在突触间的正 常传导l1]，它也是有机磷农药(OPs)的靶酶_2]。AChE和 OPs结合后使酶活性中心丝氨酸羟基发生磷酰化， 使其不能再参与水解乙酰胆碱，造成突触间神经递质的积聚，导致神经传导的阻断 “]。近年来，由于基因 工程定点突变_5]、3D-QSARl6等技术的应用，人们对 AChE的结构和功能以及与抑制剂的相互作用有 了更 为深入的认识。利用 AChE被 OPs特异性抑制的原理，可以将其作为生物标志物用于农业、食品、环境、军 事等领域中有机磷化合物的检测，如，1958年Weiss就提出对环境中极低浓度的OPs可用鱼脑或无脊椎动 物的AChE活性抑制程度来检测_7]。然而，在鱼脑 AChE的粗提液 中往往还混有脂族酯酶_8等杂蛋 白，抑 制实验中这些杂蛋 白可能会降解 AChE的抑制剂或与抑制剂结合使其有效浓度降低 ，从而影响到鱼脑 AChE的动力学特性以及对 OPs的敏感性 。因此，为了真实反映AChE的动力学特性和提高酶对 OPs的敏 感性，有必要对鱼脑组织AChE进行分离纯化 。在海洋鱼类中，1995年董之海从大黄鱼(Pseudosciaenacro— cea)肌 肉中分离得到胆碱酯酶_9]。但到 目前为止，有关海洋鱼类脑组织 AChE的分离纯化及其生化性质的 研究鲜有报道。通过对 10种海洋鱼类脑组织 AChE对 OPs的敏感性进行 比较实验，发现鲅鱼对 OPs相当 敏感_1。基于此，本文用亲和层析法从鲅鱼 [Scomberomorusniphonius(Cuvier)]脑组织中分离纯化出 AChE，并对其部分生化性质进行了研究，为进一步探讨纯化的鱼脑AChE酶在海水背景下对 OPs的敏感性 提供基础。 1 材料与方法 1．1 材料与仪器 新鲜海产鲅鱼，青岛市南山水产品市场 ；碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)、碘化硫代丁酰胆碱(BTCh)，Fluka 公司；5，5一双二硫代 (2一硝基苯 甲酸，DTNB)，BW284C51[1，5一bis一(4一allyldimethylammoniumpheny1) pentan一3一onedibromade]，四异丙基焦磷酰胺 (tetraisopropylpyrophosphoramide，iso—OMPA)，普鲁卡因 胺 (proeainamide)，EDAC[1一ethyl一3一(3一dimethylaminopropy1)carbodiimide]，Sigma公司；CH—Seph— arose4B，Pharmacia公司；TritonX一100和 SDS—PAGE电泳所用的标准蛋 白质，上海生工公司。其余试 收稿日期 ：2005—07—20；修回日期：2006—05—15 基金项 目：国家高技术研究发展