实验六 目的基因的PCR扩增.ppt

PCR的应用 目的基因的获得 基因组克隆 DNA序列分析 RNA分析 基因突变 基因组的比较研究 医学疾病诊断等 七、引物设计原则 ⑷ 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性(70%)或少于连续8个的互补碱基。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。 ⑸ 引物的 5′ 末端碱基：并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其 5′ 末端碱基可以不与模板DNA匹配呈游离状态。最多可游离10个碱基并不影响PCR反应进行。 ⑹ 引物的 3′ 末端碱基：原则上要求引物的3′末端与模板DNA一定要配对，另外 3′末端的末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。 引物3′末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异，最好选T、G、C，而不选A。 七、引物设计原则 由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。 1. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不 挪作它用。 2. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能 一次性使用。 3. 每加一种反应物，应换新的枪头。 八、注意事项 1、PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过 程中各起什么作用？ 2、为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温 度变化？ 3、用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需 注意哪些事项？ 九、思考题 引物的设计的总原则：扩增的效率和特异性 长度：15—30bp 碱基尽可能随机分布（G+C含量 45-55%） 引物内部不能形成二级结构 两引物间不应有互补链存在 3’端一定要与模板严格配对 5’端可引入突变，加酶切位点等 辅助软件：Primer 5，Oligo，DNAsis等 引物Tm：DNA分子一半为单链，另一半为双链时的温度称为该复合体的溶解温度Tm，与G+C含量有关 PCR引物设计 AKP CDS 554......2038 引物1 5’GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC 3’ BamH1 CDS 5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT… …………………………………………………………………………. …… ………………………………………………………………………………. ………………………………………………………………………………. ………………………………………………………………………………. CDS ….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’ 引物2 HindⅢ 3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5’ 扩增条件的优化 优化反应参数：退火温度和时间、变性温度和时间 优化Mg2+浓度 模板的纯度，优化模板浓度 优化dNTP的浓度 优化引物浓度 PCR仪：热盖、升降温速度、精度 PCR管的质量等 PCR扩增产物的分析 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR扩增产物的回收 回收的方法很多，主要目 的是去除Taq酶等，取出目 的DNA片段进行后续操作 低熔点琼脂糖法 离心柱过滤 离心柱吸附 玻璃奶吸附 * * * * 实验六 目的基因的PCR扩增 一、实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。 PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。 是一种体外扩增特异DNA片段的技术。 二、实验原理 二、实验原理 PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下： PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性 （2）引物退火 （3）热稳定DNA聚合酶进行DNA延伸合成。 二、实验原理 1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双 链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。 2、退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基 配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分 双链DNA，即退火阶段。 3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单 链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补 DNA，即