血清乙型肝炎病毒DNA水平对HBV全基因组克隆效率的影响.pdfVIP

维普资讯 · 1384· 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2008，24(7)：1384—1389 [文章编号] 1000—4718(2008)07—1384—06 血清乙型肝炎病毒 DNA水平对 HBV 全基 因组克隆效率的影响 卢建溪 ， 钱师宇 ， 李 莉 ， 朱明芬 ， 陈 伟 ， 李 刚 (中山大学附属第三医院 。中心实验室，感染科，广东广州510630；暨南大学医学院，广东 广州 510632) [摘 要] 目的：通过比较血清HBVDNA水平对一片段 PCR法和两片段PCR法这两种不同方法的HBV全 基因组克隆效率的影响，选择出合适的HBV全基因组克隆技术，供后续的HBV的基础和临床研究。方法：采集了 慢性乙型肝炎 (CHB)患者 85份血清，分别用本研究建立的一片段PCR法及两片段PCR法扩增 HBV全基因组，经 双酶切鉴定后将PCR产物克隆入载体 ，进行 HBV全基因组序列测定。同时用实时荧光定量 PCR法检测上述85 份血清的HBVDNA滴度。结果：本研究建立的一片段PCR法扩增成功需要的血清HBVDNA浓度高于两片段 PCR法，两种方法扩增的效率比较为：一片段PCR法扩增的阳性率低于两片段PCR法 (P0．01)。一片段 PCR法 的保真性和灵敏度分析发现：保真性 ：核苷酸的人为突变率为 1．13bp／kb；灵敏度：为 10个初始模板。浓度大于 10 的重组质粒 DNA80％可以成功扩增，浓度低于该值的扩增效率比较低。结论：血清HBVDNA水平对两种扩增 方法的阳性率有一定影响，滴度高低是选择合适PCR扩增方法的依据。HBVDNA滴度大于 10。copies／L的样本， 可选用一片段PCR法的全基因组扩增 、克隆技术，而对HBVDNA滴度小于 10copies／L样本 ，则可选用两片段PCR 法的全基因组扩增、克隆技术。本研究建立的一片段 PCR法扩增 HBV全基因组克隆的技术是一种值得推荐的好 方法，但还需进一步优化。 [关键词] 肝炎病毒，乙型；基因组 [中图分类号] R34 [文献标识码] A ImpactofHBV DNA levelinseFunlonthecloningefficiencyofHBV full length genom e LUJian—Xl一，QIANShi—yu，LILi，ZHUMing—fen，CHENWei，LIGang3 (CenterLaboratory，DepartmentofInfection，TheThirdAffiliatedHospital，SunYat—senUniversity，Guangzhou510630， China；MedicalCollegeofJinanUniversity，Guangzhou510632，China．E—mail：ligang131@hotma il．com) [ABSTRACT] AIM：Tocomparethecloningefficacyoffull—lengthHBVgenomeamplifiedbysinglefragment PCR andtwofragmentPCR forchoosingthesuitablemethodofrfull—lengthHBV genomecloning．METHODS：To锄 · pl thefull—lengthHBVgenomefrom 85serasma pleofHBVpatients，singlefragmentPCRandwtofragmentPCRwere conducted．Theproductswere clonedintothevectorandsequencedafteridentifiedwithdoubleenzymedigestion．Atthe sametime，htetitem of85sma plesweredetectedbyreal—timeP