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受体放射自显影术 天津医科大学医学检验学院 孙续国 试验方法 一、标记动物 给动物注人一定数量的放射性配基，在生理条件下，它与特定的受体结合。将放射配基在组织内分布时相所处的最高点时间作为动物处死时间，动物处死后迅速取出所需的组织速冻，制备冰冻切片5-10μm。 二、自显影标本制备 1 接触法制备自显影 （1）用浸膜法将空白盖玻片涂一层核乳胶(核-4型，去离子水1：1稀释)置10℃环境中 晾干。 （2）将盖玻片有标本表面与载玻片有乳胶表面直接紧密接触，用SA-202快固胶将未涂乳胶的一端固牢，另用两块同样大小的载玻片将二者压紧，两端扎牢，放人加有干燥剂的切片盒内，密封后，在4℃冰箱曝光。 （3）确定曝光时间，取出曝光玻片室温平衡0.5h，暗室操作取出玻片（19土1℃） 用D-19b显影液显影3min，F-5定影液定影8-10min。 （4）用10%甲醛液固定，适量。 （5）流水冲洗30~60min。 2 融裱浓法制备自显影 （1）将冰冻切片直接融裱在涂有核-4型乳胶(去离子水l:1稀释)的载玻片上，置10℃环境中晾干。 （2）确定曝光时间（根据放射线性质）。 （3）用D-19b显影液显影 3min，F-5定影液定影8~10min （19土1℃条件下进行）。 （4）再用10%甲醛液固定。 （5）流水冲洗30~60min，克紫染色。 组织切片放射配基(体外)结合研究 一、组织切片标本制备 （1）将实验动物处死后，迅速取出所需的组织，剪成 0.2~0.5cm3的小块浸人干冰己烷混合液中速冻后移至恒冷箱。 （2）切片机中平衡2h，切成6-7μm的冰冻切片，切片裱贴于涂有明胶的载玻片上(100mg/100ml铬矾/明胶)的载玻片上，迅速用冷风吹干。 (3) 干燥后标本分为两部分。实验组切片以预实验选定的放射性配基浓度、保温温度与时间、保温液的pH值等条件进行结合实验和分离洗涤。 （4）切片干燥后用接触法进行自显影操作，最后观察结果。对照组切片与实验组实验条件相同，并加入500-1000倍的非标记配基，以阻断放射性配基受体的特异性结合，可得到非特异性结合放射性。实验组切片中放射性即为总结合放射性。 最佳结合条件的选定 1 标记配基浓度选定: （1）将标本置于带盖封闭试验盒中，漂浮在25℃的水浴锅中。 （2）在平行的切片标本(选5-10张载玻片)，滴加不同浓度为0.2-20nmol/L的标记配基，保温20min。 （3）Tris-HCl缓冲液中冲洗，操作时间、条件一致。 （4）最后，蒸馏水快速冲洗一次，快速吹干，收集全载玻片上的组织进行放射性测量。 （5）筛选出结合率高并且稳定的标记配基浓度。 最佳结合条件的选定 2 保温时间的选定 （1）标本于带盖封闭的盒，并漂浮在25℃的水浴中。 （2）平行的标本(载玻片)上滴加选定浓度的标记配基。 （3）选择恒温，作用时间为：10、20、30、40、50、60min， Tris-HCl缓冲液冲洗后。 （4）用蒸馏水中快速冲洗一次，快速吹干后收集载玻片上的所有组织，进行放射性测量。 （5）根据试验结果选出结合率高，而且隐定的反应时间。 最佳结合条件的选定 3 作用温度的选定 （1）将平行的标本置于带盖封闭的试验盒中，温度设置冰浴和水浴(温度分别设定为：5、15、25、35℃)。 （2）标本上滴加所选定浓度的放射性配基，按选定的时间进行保温， Tris-Hcl缓冲液冲洗。 （3）用蒸馏水快速冲洗，吹干后收集载玻片上所有组织。 （4）检测标本放射性，选择结合率高而稳定的保温温度。 最佳结合条件的选定 4 放射性配基液pH值的选定 （1）按选定的作用温度、作用时间、配基浓度进行实 验。 （2）选择放射配基溶液的pH值范围。 （3）按照作用后洗涤、吹干，刮下每张载玻片上的组织。 （4）测量放射活性量，选出结合率高而稳定的保温液的pH值。 最佳结合条件的选定 5 结合与游离配基的分离 （1）根据上述选择条件，标记配基与分析标本作用。 （2）Tris-HCl缓冲液洗涤3次。 （3）固定洗涤条件，设定时间作变量，然后收集标本组织。 （4）测定放射性测量，选择放射性明显降低又能保持相对恒定的最短洗涤时间。 受体特性检验 1 饱和曲线 （1）标记不同浓度的配基，固定作用最佳结合条件进行作用。 （2）收集标本组织，根据标记同位素性质选择测定放射活性。 125I标记配基可直接进行放射性测量，经作图后可得到受体的饱和曲线。由饱和曲线计算出受体最大结合容量和 K’值。 受体特性检验 2 竞争曲线法 （1）选择不同浓度的受体的阻断剂或非标记物。 （2）选择最佳反应条件，标记物与受体竞争反应，测定随阻断剂或非标记物浓度的增加，标记配基与受体的放射活性。 （3）根据